Para poder hacer una clasificación de los organismos procariotas hay que hacer análisis genéticos, estructurales y de comportamiento. Además, su nomenclatura (su forma de llamarlos) debe cumplir ciertas reglas.
Vamos a ver todo esto, pero antes nos centraremos en las hipótesis sobre la vida de los microorganismos en la tierra primigenia, ya que, a partir de estos microbios primitivos, se forman los árboles filogenéticos a partir de los cuales se generan las clasificaciones actuales de los seres vivos.
La tierra se formó hace 4600 millones de años. Se cree que la vida precelular pudo ser un ‘’mundo de RNA’’, ya que esta molécula tiene, tanto la capacidad de replicarse, como la de catalizar reacciones enzimáticas.
Se puede considerar que la vida surgió hace 3500-3800 millones de años. Esto es debido al hallazgo de unos microfósiles de procariotas hallados en unos estromatolitos del oeste de Australia. Los estromatolitos son un tipo de rocas estratificadas formadas por la incorporación sedimentos minerales sobre poblaciones bacterianas laminadas.
Estos estromatolitos están formados por unas bacterias filamentosas anaerobias y fotótrofas, con fotosíntesis anoxigénica, aparentemente relacionadas con una bacteria fotótrofa anoxigénica actual llamada Chloroflexus. Las cianobacterias y la fotosíntesis anoxigénica se desarrollaron más tarde.
La diversidad microbiana se incrementó a medida que el oxígeno se hizo más abundante (hace 2000 millones de años).
Los eucariotas surgieron a partir de procariotas. La hipótesis más extendida sobre el origen de los eucariotas es la teoría endosimbiótica, que propone que las mitocondrias y cloroplastos surgieron de la incorporación estable dentro de otro tipo de célula. Las mitocondrias provendrían de una bacteria quimioheterótrofa anaerobia facultativa, mientras que los cloroplastos de una bacteria con fotosíntesis oxigénica.
Las mitocondrias surgieron de un grupo de proteobacterias (que es un grupo muy amplio de GRAM negativas), concretamente de la clase alfa (α). Los cloroplastos parece que provienen de un Phylum común con las cianobacterias (tanto cianobacterias como cloroplastos llevan a cabo fotosíntesis oxigénica).
Esta teoría se basa en la fisiología y su metabolismo, además de en la propia secuencia y estructura de mitocondrias y cloroplastos, ya que contienen ribosomas del tipo procariota, y tienen secuencias génicas del RNAr 16S característicos de procariotas. Los ribosomas de mitocondrias y cloroplastos son sensibles a los mismos antibióticos que los de los procariotas. Además, contienen una pequeña molécula de DNA circular, típica de procariotas.
Dentro de esta teoría se han propuesto dos hipótesis:
Las arqueas no tienen núcleo; entonces esta teoría sostiene que el núcleo se originó después, tras la asociación y transferencia de los genes responsables de síntesis de lípidos desde el simbionte al cromosoma del hospedador. A partir de esa síntesis de lípidos se forma todo el sistema de endomembranas y la membrana nuclear. Esta célula con núcleo y poseedora de mitocondrias habría adquirido después el ancestro de cloroplastos por endosimbiosis.
Lo que está claro es que la célula eucariota es una quimera, ya que tiene características de bacterias y de arqueas. Los eucariotas tienen un tipo de lípidos presentes en bacterias, al igual que su metabolismo energético. Tienen sistemas de transcripción y traducción más parecidos a los de arqueas. Es probable que el proceso evolutivo se prolongara largos periodos de tiempo y que sufriera numerosos arranques en falso y callejones sin salida, además de haber sido un proceso evolutivo no lineal.
El origen de la célula eucariota podemos considerarlo como un punto de partida para la explosión de la diversidad biológica (aparición de los seres pluricelulares, vida animal, fúngica, etc).
Es la ciencia de la clasificación biológica. Se compone de clasificación, nomenclatura e identificación:
Es el estudio científico de los microorganismos, cuyo objetivo final es agruparlos taxonómicamente. Abarca disciplina variadas como morfología, biología celular, ecología, etc.
La sistemática es la ciencia que asocia la taxonomía con la filogenia (historia evolutiva de los organismos). El objetivo clave de la taxonomía es la comprensión de la filogenia, ya que la jerarquía taxonómica tiene que reflejar la jerarquía filogenética: agrupar los microorganismos por características comunes implica que ese grupo ha evolucionado a partir de un ancestro común, de tal manera que cada especie retiene características de sus ancestros.
La mayor parte de la información para establecer la filogenia proviene de fósiles, pero los microorganismos no fosilizan con facilidad. A falta de evidencia fósil, en el caso de la filogenia de procariotas; hay que recurrir a otros datos. En el caso de eucariotas, los estudios de secuenciación del DNA concuerdan muy bien con los registros fósiles (que en eucariotas si hay). Esto ha llevado a los científicos a establecer la filogenia de procariotas mediante de estudios de secuenciación y de hibridación.
Para ello eligen determinadas secuencias del genoma: las moléculas elegidas han sido las de RNA, ya que son los mejores cronómetros evolutivos. Más concretamente los RNAr de la subunidad pequeña (SSU rRNA: Small ribosomal Subunit RNA): el 16S en procariotas y el 18S en eucariotas. A partir de ellas se deducen filogenias microbianas.
Están presentes en todos los organismos (tienen distribución universal) y en todos realizan la misma función. Además, como el ribosoma es esencial para la supervivencia, los genes que codifican sus componentes no pueden soportar grandes cambios, ya que resultan letales: los ribosomas tienen una estructura secundaria determinada y muy específica.
Los cambios que se mantienen y que podemos observar han sido cambios muy lentos y muy leves. Esto permite comparar organismos muy separados en la evolución. Además, no están sujetos a transferencia génica horizontal: no se transfieren por plásmidos, debido a que están en el cromosoma.
En base a comparaciones de las secuencias del SSU rRNA se han podido establecer relaciones evolutivas y arboles filogenéticos. Se han creado los tres dominios principales. La longitud de las ramas indica relaciones evolutivas entre organismos, pero no tiempo.
Los árboles filogenéticos se establecen:
Un árbol tiene ramas y nodos internos y externos. Pero pueden o no tener raíz, en el sentido de saber cuál es el ancestro común de varias especies, géneros, cepas, etc.
Los nodos donde hay números son especies, cepas, géneros, y etc. Los nodos internos son ancestros, es decir los nodos externos son los actuales. Las ramas determinan el orden de descendencia y los ancestros de los nodos, los que son los ancestros de las cepas actuales. La longitud de esas ramas no indica realmente tiempo sino el número de cambios que se han producido.
Si no hay raíz, el árbol no da una idea evolutiva, solo se establecen relaciones de parentesco. Con raíz se da cierta idea evolutiva.
La distancia evolutiva (relación de organismos) es la forma en la que se indica, cuantitativamente, el número de posiciones que difieren dos secuencias nucleotídicas alineadas. Es decir, indica la relación entre los organismos. La relación se mide en distancia evolutiva. Los organismos se agrupan en función de las semejanzas de sus secuencias.
Hay un método muy empleado para establecer las relaciones filogenéticas: el análisis de parsimonia. Las relaciones se determinan calculando el número mínimo de cambios necesarios para llegar a las secuencias finales que se están comparando, suponiendo que el cambio evolutivo se produce por la vía más corta (menor número de cambios desde el antecesor hasta el organismos en cuestión).
Con el análisis informático del alineamiento de secuencias del SSU rRNA se ha confirmado la presencia de unas secuencias firma: secuencias cortas y conservadas, específicas para un grupo filogenéticamente definido de organismos. Se pueden definir secuencias firma características de dominio, género o especie particular. Ayudan a clasificar organismos aislados recientemente o previamente mal clasificados en su grupo filogenético correspondiente.
Gracias al análisis filogenético se han podido establecer los 3 dominios fundamentales: Bacteria, Archaea y Eukarya.
La taxonomía en procariotas se puede considerar taxonomía polifásica: engloba varios métodos con diferentes análisis.
En el análisis fenotípico se tiene en cuenta:
Este tipo de análisis tiene en cuenta diferencias metabólicas, estructurales, etc. En estudios clínicos donde es necesario la identificación existen toda una serie de rasgos fenotípicos que permiten, clara y rápidamente, discriminar entre la identificación más probable.
Las características morfológicas establecen morfotipos dentro de una especie. Pero en sí mismas no dan mucha información. Al microscopio óptico dos especies pueden ser muy parecidas morfológicamente; por ejemplo, dos cocos. Por eso puede servir de ayuda el que presente ciertas estructuras como endosporas, flagelos, etc. Las tinciones diferenciales permiten diferenciar algunos grupos de organismos pero no siempre se pueden aplicar ni dan demasiada información; tienen utilidad limitada (por ejemplo, no tiene sentido hacer tinción de GRAM a micoplasmas o arqueas).
Las características metabólicas, bioquímicas y fisiológicas permiten establecer biotipos. Se realiza mediante pruebas bioquímicas o técnicas de quimio taxonomía.
Las características serológicas permiten establecer serotipos, como el sistema de Lancefield. Si disponemos del antisuero adecuado con anticuerpos específicos, como la unión antígeno anticuerpo es específica, con esos anticuerpos podremos clasificarlo si se unen al microorganismo.
La sensibilidad a fagos permite establecer fagotipos. Se realiza mediante pruebas de fagotipia: consisten en ensayos en los que se trata de determinar a qué fagos es sensible una determinada bacteria. Los fagos son específicos y suelen infectar a una especie concreta o una variante concreta. Se siembra cada cepa en una placa diferente y se siembra uniformemente la cepa en cuestión. Después, se inoculan los distintos fagos en cada una de las cuadriculas, se incuban las placas y se observa si hay o no lisis. Si el fago ha lisado la bacteria, aparece halo de lisis y quiere decir que la bacteria es sensible a ese fago. Esto permite comparar diferentes cepas por su sensibilidad a fagos.
En el análisis genotípico se estudia:
El contenido en G+C. Puede fluctuar del 20-80%. Fluctúa más en procariotas que en eucariotas. Es posible que dos organismos puedan tener el mismo contenido de G+C pero ser organismos muy distintos: a partir de una composición de bases muy parecida se pueden obtener secuencias muy diferentes y dar lugar a numerosos organismos.
Realmente el análisis químico del porcentaje G+C no es fiable taxonómicamente, y se está quedando obsoleto: va siendo sustituido por el análisis in silico. Con el tiempo quedará para confirmar la asignación de un organismo a un taxón superior.
La hibridación DNA-DNA (DDH) se basa en el hecho de que, al calentar el DNA de dos organismos, las dos cadenas se van a desnaturalizar, y el enfriamiento lento permite la renaturalización. Al estar mezclados los DNA de ambos organismos, pueden hibridar siempre y cuando las secuencias sean iguales o similares. El grado de hibridación nos indica el grado de parentesco. Cuanto mayor sea el grado de hibridación mayor es el parentesco.
Se prepara el DNA de ambos organismos. Uno se fragmenta y se marca con fosfato radiactivo. Se desnaturalizan ambos DNA y se mezclan. Siempre hay que añadir una cantidad saturante del DNA sin marcar para evitar que el marcado hibride consigo mismo. A continuación, se separa el DNA hibridado del no hibridado y se mide la cantidad de radiación.
Se interpretan los resultados observando la radiactividad, viendo que el 100% va a ser el DNA que ha hibridado consigo mismo. Dos cepas son de la misma especie si los valores DDH ≥ 70%. Dos cepas son del mismo género si los valores DDH ≥ 25%. Si es menor no pertenecen al mismo género.
Hibridación DNA-RNA (DRH). Estos experimentos también se pueden hacer con DNA de uno y RNA de otro. Estas pruebas permiten la clasificación y también la identificación rápida de algunas bacterias mediante "sondas" adecuadas. Una sonda es una cadena específica de ácido nucléico que, una vez marcada, se puede utilizar para que hibride con su complementaria en una mezcla con ácidos nucléicos.
Por ejemplo, si estamos analizando un alimento para ver si se ha contaminado con Salmonella, lo que se hace es obtener la sonda. El DNA de esta batería se fragmenta con enzimas de restricción y se selecciona un fragmento adecuado, es decir, un fragmento que solo este en Salmonella y no en otras bacterias. Se marca radiactivamente o con fluorescencia. Por otro lado, la muestra de alimento se filtra y las bacterias presentes en el alimento crecen porque se hacen crecer en medio adecuado. Obtenemos cadenas sencillas y si hay DNA de Salmonella la radiactividad o la fluorescencia permite identificar la bacteria.
Por otro lado, la prueba de la huella genómica no requiere secuenciación de nucleótidos. Se trata de generar patrones de fragmentos de restricción (que son fragmentos de DNA obtenidos con enzimas de restricción) para analizar la semejanza genotípica entre las cepas. Permite discriminar a nivel de especie, subespecie, y a menudo cepa, por lo que es válido en clasificación. Hay distintos métodos:
Ribotipado. Es un método especifico y rápido y se centra en un solo gen, en concreto en el gen que codifica el RNAr de la subunidad pequeña (SSU rRNA). Pasos para el ribotipado:
Se trata de amplificar por PCR el DNA que codifica el RNA ribosómico de la unidad pequeña. Se marcan y ya tenemos la sonda marcada. Después, se tratará con enzimas de restricción el genoma del organismo y esos fragmentos se separan por electroforesis. Solamente hibridará donde aparezca su cadena complementaria. Ese perfil va a ser único para una determinada especie bacteriana. Este perfil generado se digitaliza y se compara con otros de otros microorganismos. Hay otros que analizan la variación en la secuencia del DNA en el genoma completo; no se centran en un gen sino en el genoma completo.
Análisis de secuencias repetitivas de DNA. Hay una serie de secuencias en los genomas que están altamente conservadas y de las cuales hay un gran número de copias. Hay 3 grandes familias de secuencias repetitivas: REP-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR), ERIC-PCR (enterobacterial repetitive intergenic consensus) , BOX-PCR. Su número y posición difiere entre cepas cuyas secuencias han divergido.
Es una técnica válida en el estudio de la diversidad microbiana e identificación de patógenos. La muestra puede proceder de un individuo que se sospeche que tiene el microorganismo o que lo tengamos aislado en el laboratorio. El proceso comprende 3 partes:
AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism). Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción amplificados.
El MLST (Multilocus sequence typing; análisis de secuencias multilocus). Permite caracterizar cepas dentro de una misma especie. Tiene un nivel de restricción demasiado elevado, por lo que se usan para proporcionar información a nivel de género y familia: da una excesiva resolución para niveles superiores. Se desarrolló para rastrear cepas patógenas, pero su aplicación se ha extendido a la taxonomía microbiana.
Implica la secuenciación de fragmentos de varios genes esenciales, de mantenimiento básico celular. Son unos 5-10 genes, que van a estar en el cromosoma y no van a estar sujetos a transferencia horizontal. Se comparan con las de genes equivalentes de otras cepas del mismo organismo.
Un alelo del gen se representa con un número. A cada cepa se le asigna un perfil alélico, que es una serie de números (tipificación de secuencia multilocus). Cada perfil alélico define el ‘’tipo de secuencia’’ (ST). Esto establece si entre dos cepas existe algún tipo de relación.
El grado de relación entre los distintos perfiles alélicos se representa en forma de diagramas con forma de árbol (dendrograma).
Distancia 0 = cepas idénticas
Distancia 1 = poco relacionadas.
El problema es la selección de los genes que van a ser comparados. Si no se seleccionan bien los genes puede que no se refleje la auténtica filogenia de ese microorganismo.
En el análisis filogenético se tienen en cuenta los análisis:
Los datos filogenéticos son un componente clave de la taxonomía polifásica. Utiliza las secuencias de múltiples genes a la vez para describir e identificar organismos.
Si realizamos el análisis de genes individuales, vemos que el análisis de SSU rRNA ha permitido establecer relación entre especies. Si dos especies difieren en más de un 3%, no son de la misma especie, ya que su grado de hibridación es menor del 70%. Su poca divergencia limita su eficiencia en la discriminación a nivel de especie. El problema puede evitarse analizando genes con mayor grado de divergencia.
Muchos genes tienen el inconveniente de que se transfieren horizontalmente. Para evitar eso, en filogenia son más frecuentes las estrategias basadas en análisis de secuencias multigénicas. Es similar a la técnica MLST pero con secuencias completas de genes. La secuenciación de genes no relacionados funcionalmente va a permitir:
El análisis en secuencias genómicas completas es el análisis comparativo de genoma; se compara todo con todo. Proporciona numerosos rasgos para el análisis genotípico comparativo. No está sometido a sesgo en la selección de secuencias ya que se analiza todo contra todo.
Se hace mediante la técnica FISH: hibridación fluorescente in situ. Hace falta disponer de una sonda. El procedimiento lleva 4 pasos:
El uso de ciertas sondas puede detectar microorganismos no cultivados. Pueden aplicarse directamente:
Se emplea habitualmente en:
Se basa en el sistema binomial de Linneo. Esta nomenclatura, usada también para describir al resto de seres vivos (aunque con algunas modificaciones), tiene varias reglas:
La especie procariota es un concepto distinto al de especie de organismos superiores. Pero la definición de especie que se da para organismos no es válida en microbiología, ya que en el caso de los procariotas son organismos haploides sin reproducción sexual.
Especie procariota: grupo monofilético de organismos (grupo de cepas) con el suficiente grado de coherencia o semejanza genotípica y fenotípica como para diferenciarse de sus semejantes. Los individuos tienen un cierto grado de diversidad fenotípica interna (variación genética).
Hay dos rasgos genotípicos esenciales para agrupar cepas dentro de una misma especie: semejanza de frecuencia en SSU rRNA y la hibridación de DNA. Si los genes de sus SSU rRNA tienen ≥ 97% de secuencias idénticas (lo que implica un % de G+C similar) y un grado de hibridación del DNA > 70%. dos procariotas pertenecen a la misma especie.
Idealmente una especie también se debería distinguir fenotípicamente de otras especies similares.
Una cepa (estirpe) es una población clonal formada por descendientes de una sola célula, pero sin descartar una divergencia a partir de la parental, originando células distintas. Dentro de una especie se pueden diferenciar morfotipos, biotipos, serotipos y fagotipos.
Un clon es una población de células genéticamente idénticas (iguales y descendientes de una sola célula).
En la sección de bacterias se seguirá una clasificación de acuerdo con la descrita en la segunda edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática. Es un tratado esencial sobre la taxonomía de procariotas (bacterias y arqueas). La clasificación se basa en las comparaciones de las secuencias de ácidos nucleicos, en especial las secuencias del SSU rRNA. Consta de 5 volúmenes y engloba 25 filos:
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