Métodos de control del crecimiento microbiano

Para el control del crecimiento microbiano se pueden destruir a los microorganismos o inhibir su crecimiento. Hay dos procesos de destrucción:

  • Esterilización. Proceso de destrucción de todas las formas vivas en un objeto o material, incluidas las de resistencia. Es un concepto absoluto: un objeto no puede estar ‘’un poco’’ esterilizado, o lo está o no lo está.
  • Desinfección. Proceso de destrucción de las formas vegetativas de los patógenos pero no necesariamente endosporas o virus. Es una operación para eliminar agentes infecciosos. Un agente desinfectante no necesariamente esteriliza el medio.

El control del crecimiento microbiano puede aplicarse por métodos físicos (calor, bajas temperaturas, filtración, etc) o por agentes químicos. Los agentes pueden ser:

  • Agentes microbioestáticos. Inhiben el crecimiento.
  • Agentes germicidas/microbicidas. Destruyen el crecimiento. Matan las formas de desarrollo pero no necesariamente las formas de resistencia. Los germicidas engloban a los desinfectantes (está restringido a ser usado solo sobre objetos inaninamos) y antisépticos (sustancias de aplicación tópica: tratamiento de heridas, por ejemplo). Si tienen aplicación tópica, no puede ser toxico para la piel, ni las mucosas, ni puede ser ingerido.

Desgerminización: eliminación pasajera de microorganismos de la piel, mediante limpieza mecánica o aplicación de un antiséptico. El término desinfectante es menos amplio que el término germicida.

Las formas de controlar el crecimiento microbiano difieren de los agentes quimioterápicos (de los antibióticos). Estos se verán en otro artículo.

Índice
  1. Cinética de muerte microbiana
  2. Control microbiano por métodos físicos
    1. Calor
    2. Otros métodos físicos de control
  3. Control microbiano por agentes químicos
    1. Fenol y derivados
    2. Alcoholes
    3. Halógenos
    4. Metales pesados
    5. Detergentes sintéticos
    6. Aldehídos
    7. Gases esterilizantes

Cinética de muerte microbiana

Para estudiar la eficacia de cualquier agente sobre una población microbiana lo primero que hay que saber es ¿Cuándo esa célula está muerta? En el caso de los microorganismos, el único criterio válido de muerte es la pérdida irreversible de la capacidad de multiplicación. En el caso de los virus (no se pueden matar, se pueden inactivar) se les considera inactivos cuando ya no pueden replicarse en un hospedador adecuado.

El efecto de los diferentes agentes en una población depende de varios factores, como el tipo de agente, el tiempo de aplicación o la dosis aplicada. No obstante, una población no se destruye de un modo instantáneo al exponerse a un agente letal. La muerte, al igual que el crecimiento, es generalmente exponencial: se reduce en niveles igual a intervalos constantes.

Esto se demuestra poniendo el cultivo en contacto con el agente y comprobando cada cierto tiempo cuantas células quedan vivas. Para ello, a distintos tiempos, cogemos una alícuota de la población, la sembramos en una placa (sin el agente) y se incuba. Según el número de colonias supervivientes, podríamos determinar el efecto del agente. Los microorganismos mueren en progresión geométrica en proporción al tiempo de exposición al agente.

A los microbicidas y los microbioestáticos se les puede añadir un prefijo dependiendo del tipo de agente y el microorganismo que destruye: si se usa contra bacterias es bactericida/ bacteriostático, si se usa contra virus es viruestático/ virucida, si se usa contra hongos es fungicida/fungistático, etc. Hay algunos agentes que destruyen bacterias pero que además las lisan: en ese casos son agentes bacteriolíticos. Haciendo recuento de viables o totales podemos distinguir el tipo de agente.

  • Si se trata de un bacteriostático, el número de totales y viables se mantiene desde el momento en el que se aplica este agente.
  • Si se trata de un bactericida, el número de totales se mantiene pero el de viables va descendiendo.
  • Si se trata de un bacteriolítico, descienden las viables y las totales, porque las lisa (desciende la densidad óptica del cultivo).
Acción de los agentes bacteriostáticos, bactericidas y bacteriolíticos en el crecimiento microbiano. (Fuente: Michael T. Madigan, John M. Martinko. 2009.  Brock Biología de los Microorganismos 12ed.)
Acción de los agentes bacteriostáticos, bactericidas y bacteriolíticos en el crecimiento microbiano. (Fuente: Michael T. Madigan, John M. Martinko. 2009.  Brock Biología de los Microorganismos 12ed.)

Control microbiano por métodos físicos

Calor

Es el método más común por ser eficaz, económico y fácil de controlar. Su ventaja es que penetra en los objetos y puede matar a los microorganismos más profundos, no solo a los de superficie.

La cinética de muerte por calor es una función exponencial de primer orden. Se produce la muerte por calor más rápidamente al ir aumentando la temperatura. Para estudiar la esterilización por calor hay que conocer una serie de parámetros que la caracterizan muy bien:

  • Tiempo de muerte térmica (TMT). Tiempo necesario para que el material quede estéril. Es el menor tiempo necesario para que todas las formas de vida, incluidas las endosporas, de un cultivo líquido mueran a una temperatura determinada y bajo condiciones especificas. Se usa menos que el TRD. Es dependiente del tamaño de la población.
  • Tiempo de reducción decimal (TRD o D). Tiempo en minutos en el que se destruye el 90% de la población microbiana, a una temperatura dada (indicada con un subíndice, por ejemplo D121). Es independiente del tamaño de la población y se calcula mediante recuento de viables. También se puede definir como el tiempo que tarda en reducirse un ciclo logarítmico. Si representamos al TRD en relación a la temperatura, también es exponencial: al representar logD / Tª se obtiene una línea recta. Al aumentar la temperatura desciende el TRD. La pendiente de la recta nos da una medida cuantitativa de la sensibilidad del microorganismo al calor (bajo las condiciones empleadas).
  • Valor z. Aumento de temperatura necesario para reducir D a una décima parte de su valor. Tanto D como z se emplean mucho en la industria conservera para conocer el tiempo y la temperatura adecuados en un proceso de conservación. Hay que aplicar los parámetros justos para no modificar el alimento excesivamente, pero asegurarnos que hemos eliminado los patógenos.  

Además, no son valores fijos, dependen no solo del microorganismo y la Tª, sino también del ambiente en el que se encuentran. La velocidad de destrucción depende, por ejemplo, de la cantidad de materia orgánica presente en el medio. La materia orgánica protege de la destrucción.

Dentro de los métodos para aplicar calor aparecen dos tipos de calor: húmedo y seco. En función del tipo de calor, se usará uno u otro método.

Calor húmedo

La muerte es más rápida con calor húmedo, porque el agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura tridimensional de las proteínas. Además el calor degrada los ácidos nucleicos, modifica las membranas; en resumen, altera la célula. Los métodos que emplean calor húmedo son:

  • Ebullición. Es una desinfección a 100ºC. Mata a la mayoría de bacterias y hongos e inactiva muchos virus en poco tiempo, pero hay algunas bacterias en forma vegetativa que no se destruyen a 100ºC (como las termófilas).
  • Vapor a presión. Por medio de un autoclave, que aumenta mucho la temperatura por medio de aplicar presión. Tiene una cámara metaliza de doble pared que introduce vapor a una presión regulada. Es clave que, para que funcione el autoclave, hay que extraer el aire del interior: dentro sólo puede haber vapor a presión, NADA de aire. Consiste básicamente en elevar la temperatura elevando la presión: 1atm por encima de la atmosférica, lo que eleva la Tª hasta 121ºC. Es un medio de esterilización. Es el método preferido de esterilización; se emplea siempre a menos que el material pueda resultar dañado en el proceso.
  • Tindalización. O esterilización fraccionada. Se emplea en algunos medios bacteriológicos y algunas sustancias químicas que no soportan temperaturas superiores a 100ºC. Se hacen tres tratamientos de 30min a 80-100ºC a lo largo de tres días con periodos de incubación entre los procesos de tratamiento. Si hay endosporas serán destruidas en uno de los procesos, si no en el primero será en el segundo o en el tercero.
  • Pasteurización. No es un método de esterilización, sino de desinfección. Consiste en aplicar un calor controlado, no muy elevado, con el fin de reducir los microorganismos de alimentos perecederos. Se trata de reducir a los patógenos y los niveles de los microorganismos responsables de la descomposición de los alimentos.
    • HTST: temepratura elevada a 72ºC durante 15 segundos. Elimina a los microorganismos.
    • UPERISACIÓN O UHT. Tratamiento muy común desarrollado para evitar, por ejemplo, un sabor caramelizado de la leche, evitando que estos alimentos pierdan su calidad. El contacto con el calor es por un tiempo menor. Se consigue mantener una mayor vida útil de almacenamiento de esos alimentos.

Calor seco

Mata por el efecto de la oxidación. Se requiere más tiempo y mayor intensidad de calor porque la conducción de calor es más lenta en aire seco que en aire húmedo. Los tratamientos deben de ser más intensos.

  • Flameado. Equivale a una incineración. Se realiza una esterilización.
  • Hornos Pasteur y hornos de aire caliente.

Se necesitan métodos más severos. Los objetos de mayor tamaño requieren incluso más tiempo. Al elevar la temperatura unos 10 grados se acorta el tiempo de esterilización un 50%. El calor seco en cuanto al calor húmedo tiene la ventaja de que no corroe los utensilios metálicos.

Es una esterilización lenta e inapropiada para materiales termolables (como plásticos o gomas).

Otros métodos físicos de control

Bajas temperaturas

Son bacteriostáticas: las células no mueren, solo dejan de crecer. Incluye refrigeración y congelación.

La mayoría de los patógenos son mesófilos, aunque algunos psicrófilos o psicrótrofos pueden deteriorar alimentos refrigerados (como Listeria mogetogenes). Como la mayoría no soporta esta temperatura conviene que los equipos de refrigeración trabajen a menos de 4ºC.

En cuanto a la congelación, no pueden crecer a 0ºc, y a 20ºC se encuentran congelados (aunque no se destruyen). De hecho, en los laboratorios, las colecciones de cultivos microbianos se conservan congelados, porque permanecen viables.

Desecación

La mayoría no pueden crecer con aw<0’9, pero permanecen viables durante mucho tiempo. Esta peculiaridad del cese de crecimiento por desecación se ha usado para la conservación de alimentos.

Dentro de la desecación encontramos: evaporación (causa daños químicos a los microorganismos, no en laboratorios) y sublimación (precisamente en esto se basa la liofilización). Para liofilizar un microorganismo hay que congelarlo y luego se introduce en la cámara del liofilizador; a esa cámara se le hace un vacio parcial. La sublimación evita los daños químicos por calor. También se usa para conserva proteínas, hemoderivados, etc.

Presión osmótica

Se elevan las concentraciones de un soluto que eleva la presión osmótica. Se usa para conservar alimentos. Está basado en los efectos de la presión osmótica. Una alta concentración crea ambientes hipertónicos, lo que provoca que salga el agua de las células bacterianas: se produce una plasmólisis. El efecto es similar a la desecación, se evita que la célula tenga humedad.

Los hongos y las levaduras son capaces de crecer en materiales con menor humedad y más elevada presión osmótica que las bacterias: esta propiedad es la razón por la que, por ejemplo, las frutas resulten más afectadas por los hongos que por las bacterias (las frutas suelen ser ácidas, lo que las bacterias no lo soportan, pero los hongos sí porque son un poco acidófilos), además es la razón por la que pueden enmohecer lugares húmedos.

Filtración

No destruye a los microorganismos; los elimina. Un filtro es un dispositivo con poros de un diámetro demasiado pequeño para que pasen los microorganismos pero lo suficientemente grande para que pasen líquidos o gases. Hay diferentes tipos de filtros:

  • Filtros de profundidad. De fibra de vidrio, porcelana, silicato; en general, de materiales fibrosos o granulados que se unen para formar una capa gruesa rellena de canales retorcidos y estrechos de un diámetro pequeño. Las bacterias quedan retenidas en esta trama.
  • Filtros de membrana moleculares. Filtros circulares, que son membranas porosas compuestas por polímeros de gran resistencia, como de acetato de celulosa o fluoruro de polivinilo. Actúa como un tamiz y retiene las bacterias y las partículas en la superficie, no atraviesan las membranas. Los más utilizados son membranas de un diámetro de poro de 0,22 micras o de 0,45 micras. Estos filtros suelen estar precedidos por un filtro de profundidad (lo que se denomina precinto) para eliminar partículas de mayor tamaño que podrían obstruir los poros de la membrana. A veces se tiende a forzar el paso del líquido a través de la membrana por medio de presión negativa en el frasco receptor. Tras la filtración, el líquido filtrado hay que mantenerlo estéril.
  • Filtros de nucleación. Películas o membranas muy finas de policarbonatos con unos poros muy uniformes dispuestos casi verticalmente a través de estas películas tan finas. Estos poros se producen tratando las membranas por radiación nuclear, lo que provoca microlesiones; luego se adiciona un producto químico que aumenta esa microlesión y aumenta el poro. El tamaño del poro está muy determinado y para controlarlo se tiene muy en cuenta  el producto que se adiciona y el tiempo de adición. Se usan para el estudio con microscopio de barrido, ya que forma una película muy uniforme
  • Filtros HEPA. Filtros de alta eficiencia para retener las partículas del aire. Se considera que eliminan el 99’97% de las partículas mayores de 0’3 micras.

En general, en la industria se usa la filtración para reemplazar la pasteurización, ya que la filtración causa un daño aún menor que la ligera alteración causada por la pasteurización. Actualmente, se filtran algunos vinos dulces y algunas cervezas. No ocurre solo en la industria alimentaria, sino también en muchos productos farmacéuticos. La filtración se usa para esterilizar soluciones termolables como vitaminas o antibióticos.

Radiaciones

Se clasifican atendiendo a su longitud de onda: desde las gamma con menor longitud de onda, pasando por el espectro visible, hasta las ondas de radio con la longitud de onda mayor. En general podemos decir que la luz visible y las longitudes de onda más largas no son significativamente letales (tienen menos energía asociada) pero la luz visible muy intensa puede llegar a matar en presencia de oxígeno y de pigmentos fotosensibilizadores como el azul de metileno; en esas condiciones el oxígeno puede pasar a oxígeno en estado singlete, que es muy letal. Es una forma de mayor energía en la que los electrones (e) externos son muy reactivos y pueden provocar oxidaciones muy graves en las células.

Las radiaciones que pueden matar son todas de una longitud de onda más corta que la luz visible: la ultravioleta (la de 265 nm es la más letal, daña el DNA produciendo dímeros de pirimidinas adyacentes, sobre todo de timinas), las ionizantes, etc.

Fotoreactivación. Es un proceso de repación del DNA en el que se reparan los dímeros de timinas. Depende del enzima fotoliasa, que repara el DNA. Esta enzima está codificada por el gen phr. Reconoce en la oscuridad los dímeros de timina y se une a ellos, y se activa en presencia de luz visible de 420-540nm, deshaciendo ese dímero de timina. Por esto, los experimentos con UV se realizan en lugares con luz tenue.

La luz UV solo mata microorganismos superficiales, no puede penetrar los materiales. No atraviesa ni el cristal. Existen lámparas de vapor de mercurio germicidas con 253,7nm que se colocan en las cabinas de seguridad biológicas para esterilizar. La luz UV se emplea en el control microbiano del aire. También en el agua de bebida, residual, etc. Los patógenos mueren al pasar una capa delicada de agua por estas lámparas.

En cuanto a la radiación ionizante, pueden ocasionar la expulsión de e de los átomos. Se emplean para matar microorganismos porque producen ionizaciones en cadena. En el caso del agua, la ioniza y produce radiales OH y H2O2 que son muy reactivos, y el resultado es la muerte celular. También se le denomina esterilización fría: estas radiaciones producen poco calor en el material irradiado. La unidad de esta radiación es el roentgen: medida de la energía radiante procedente de una fuente de radiación.

Para las aplicaciones biológicas el parámetro usado en la dosis de radiación absorbida, que se, mide en rad. Muchas veces se mide en grays (Gy) = energía absorbida por unidad de masa. Hay un parámetro: la dosis de reducción decimal, la cantidad de energía necesaria para reducir 10 veces la carga microbiana (D10). No todos los microorganismos son igualmente resistentes. En general, los organismos unicelulares son mucho más resistentes que los organismos pluricelulares. Por ejemplo, un valor D10 supera los 200 grays; la dosis letal de radiación para el hombre es inferior a 10 grays.

Tiene numerosas aplicaciones industriales: para esterilizar contenedores de plástico (placas de petri, frascos de plástico…). Se emplea el 60Co y el 137Cs. También para aumentar la vida de anaquel, es decir, la vida útil de los alimentos perecederos (De hecho, la FDA tiene una lista con los alimentos aprobados para ser irradiados). Se emplean también para esterilizar materiales quirúrgicos, farmacéuticos, materiales desechables como jeringuillas, etc.

Control microbiano por agentes químicos

Fenol y derivados

El fenol es el primer germicida de uso generalizado empleado en el siglo XIX por Lister para reducir el riesgo de infección durante las operaciones quirúrgicas. Se usa como patrón de referencia con otros desinfectantes, para evaluar su acción germicida. Aun sigue en uso el fenol, aunque hay otros desinfectantes (sus derivados) que son más potentes y más activos.

Actualmente el fenol y sus derivados se emplean como desinfectante en laboratorios y hospitales: desnaturalizan proteínas y alteran las membranas celulares. Poseen algunas ventajas: destruyen a Mycobacterium tuberculosis, son eficaces en presencia de materia orgánica, y permanecen activos en las superficies tiempo después de su aplicación. Pero también tienen inconvenientes: olor bastante desagradable y pueden causar irritación cutánea.

Un derivado (el hexilresorcinol) tiene una aplicación como antiséptico en lociones y jabones; es más eficaz que el fenol porque reduce la tensión superficial y eso contribuye a su acción germicida.

Alcoholes

Son los desinfectantes y antisépticos más usados. Son bactericidas y fungicidas, aunque no son esporicidas. No son esterilizantes. Pueden destruir algunos virus con envoltura lipídica.

A mayor peso molecular del alcohol, mayor poder germicida, y menor solubilidad.

Los alcoholes germicidas más comunes son el etanol y el isopropanol. Se emplean a una concentración entre el 70-80%; no al 100% porque es deshidratente. Elimina tanta agua de la célula que al final la lisan. Actúan desnaturalizando proteínas y disolviendo los lípidos de las membranas.

Halógenos

El yodo y el cloro son los más utilizados.

El yodo se emplea como antiséptico cutáneo: destruye los microorganismos al oxidar los constituyentes celulares, pero además halogena las unidades de tirosina de las proteínas (las convierte en di-iodo tirosina, que hace a las proteínas no funcionales). A muy elevadas concentraciones de iodo se pueden destruir algunas esporas. Se aplica en forma de tintura de iodo, o como formas yodóforas (como el betadine, que contiene povidona yodada). La ventaja es que tienen el mismo poder germicida pero son bastante menos irritantes y manchan menos.

El cloro es el desinfectante más habitual en aguas (potables, de piscinas…). Se puede aplicar en gas o líquido, o en combinaciones químicas (como hipoclorito sódico, que es la lejía). El cloro produce ácido hipocloroso, que al final se convierte en ácido clorhídrico + oxígeno atómico. No es muy eficaz para destruir endosporas. La materia orgánica interfiere con la acción del cloro, por eso siempre se añade en exceso (para asegurar la destrucción microbiana). Otro inconveniente es el sabor y olor desagradables. Se pueden usar algunas formas que contienen cloro para potabilizar pequeñas cantidades de agua.

Metales pesados

Los iones de metales pesados se han ido considerando como germicidas, aunque son más microbioestáticos.

Se combinan con las proteínas, con los grupos sulfidrilo. También pueden precipitar directamente las proteínas celulares. Recientemente se han sustituido por otros desinfectantes o antisépticos mucho menos tóxicos y más eficaces; aunque algunos como la plata aun se usan. El nitrato de plata se usaba para combatir una enfermedad causada por Neisseria gonorrhoeae, que en los niños causaba ceguera. Para pacientes con quemaduras se puede usar la sulfadiazina de plata.

En cuanto al mercurio cada día se usa menos por su toxicidad.

Detergentes sintéticos

Son moléculas orgánicas que actúan de humectantes y emulsionantes. Pueden solubilizar residuos insolubles en agua, de ahí que se puedan considerar como agentes limpiadores muy eficaces.

Los catiónicos son los más eficaces. Entre ellos, los compuestos de amonio cuaternario poseen un nitrógeno cargado positivamente con cuatro sustituyentes y un cloro o un bromo. Alteran las membranas y pueden desnaturalizar las proteínas. Son compuestos que destruyen a la mayoría de las bacterias; si bien algunas son muy resistentes como Mycobacterium tuberculosis. No destruyen las endosporas. Los inconvenientes son que se inactivan por el agua dura y el jabón. Y algunos, como Pseudomonas, no solo no son destruidos, sino que lo pueden usar como nutriente: puede crecer en este tipo de compuestos.

Estos compuestos se emplean como desinfectantes de utensilios de alimentarios y pequeños instrumentos, y como antisépticos cutáneos (lociones o jabones).

Aldehídos

Son el formaldehido y el glutaraldehído: muy reactivos con ácidos nucleicos y proteínas. Son esporicidas y se pueden emplear como esterilizantes químicos.

El formaldehido se llama también formol. Se puede usar, a baja concentración, para desinfectar superficies. A alta concentración puede llegar a esterilizar. Es muy irritante y tiene una escasa capacidad de penetración en los objetos.

El glutaraldehído es utilizado en solución tamponada al 2% como un desinfectante muy eficaz. Es menos irritante. No se puede usar como esterilizante. Es utilizado para material en hospitales y laboratorios. También se usa para inactivar toxinas en la preparación de vacunas. Es poco estable.

Gases esterilizantes

Cuando el material es termosensible, se usan gases. El más clásico es el óxido de etileno. Es microbicida y esporicida. Se combina con las proteínas celulares y las inactiva. Es un agente esterilizante muy eficaz porque penetra rápidamente a través incluso de los embalajes y envolturas de plástico. El problema es que es muy tóxico.

Se aplica en una cámara hermética donde se hace fluir el gas una vez introducido el material. En la cámara se controlan también la temperatura y humedad. Además, se debe introducir también un gas inerte (N o CO2) porque es inflamable y explosivo. Luego, es necesario airear intensamente los materiales esterilizados para eliminar el oxido de etileno residual.

En cuanto a la β-propio-lactona: no permanece mucho tiempo, se degrada hasta su forma inactiva tras unas pocas horas. No penetra tan rápidamente en los materiales, y es tan cancerígeno como el anterior.

Recientemente, se usa más el peróxido de hidrogeno en fase de vapor (o plasma gas de H2O2: gas con partículas cargadas, que pueden manipularse con campos magnéticos). Se aplica en una cámara que no eleva mucho la temperatura. La desventaja es que es muy caro. No se pueden esterilizar algunos tipos de objetos como los que tienen celulosa, humedad, ni líquidos, ni madera, ni algodón. Se usa para algunos dispositivos médicos, productos sanitarios, etc. No deja ningún tipo de residuo tóxico.

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