Tinciones y colorantes principales en microbiolog铆a

Tras ver la teor铆a sobre colorantes y tinciones vamos a analizar las principales tinciones usadas en microbiolog铆a y los colorantes que las forman.

En este caso, las diferentes t茅cnicas de tinci贸n analizadas se usan para el microscopio 贸ptico. La mayor铆a de las muestras se podr谩n ver en el microscopio con aumentos de 20x y 50x, aunque habr谩n casos donde ser谩 necesario usar el aumento 100x (donde se a帽ade tambi茅n el aceite de inmersi贸n a la muestra).

Las tinciones principales son la de Gram y de Ziehl-Neelsen, ambas diferenciales; aunque tambi茅n hay otras tinciones diferenciales y selectivas de inter茅s para la microbiolog铆a.

Recordatorio: antes de leer este art铆culo ser铆a bueno que conozcas un poco de teor铆a sobre las fases, mecanismos y tipos de tinciones que hay (adem谩s de las partes que tienen los colorantes). Si conoces todo esto podr谩s entender mejor ciertas expresiones que son m谩s del gremio 馃槃.

脥ndice
  1. Tinci贸n de Gram
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades
  2. Tinci贸n Ziehl-Neelsen
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades
  3. Tinci贸n de Wirtz-Conklin
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades
  4. Tinci贸n de Leifson
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades
  5. Tinci贸n de Giemsa
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades
  6. Tinci贸n negativa
    1. Colorantes
    2. Preparaci贸n
    3. Utilidades

Tinci贸n de Gram

La tinci贸n de Gram es probablemente la m谩s conocida; es de tipo diferencial y sirve para distinguir a los microorganismos por morfolog铆a y composici贸n.

Hay que tener en cuenta que se debe hacer la tinci贸n cuando el cultivo esta en fase exponencial, ya que en fase estacionaria (鈥渧ejez鈥) se pueden confundir las gram positivas con las negativas. Esto ocurre debido a la perdida de capas de peptidoglicano por parte de bacterias gram positivas.

Colorantes

  • Cristal violeta. Da color azul o viol谩ceo a las bacterias gram positivas.
  • Safranina. Da color rojizo o anaranajado a las bacterias gram negativas.

Aparte de estos colorantes, en la tinci贸n de Gram se usar谩 el lugol como mordiente, y alcohol 96% para decolorar. Todas las c茅lulas (sean Gram positivas o negativas) se te帽ir谩n con el cristal violeta.

Kits tinci贸n Gram
As铆 lucen los compuestos de las tinciones: en este caso, este es el kit de los compuestos necesarios para la tinci贸n de Gram. Fuente: Fisher Scientific

Ahora bien, el alcohol quita fosfol铆pidos y cierra los poros de la pared celular, por lo que el cristal violeta queda atrapado. Las bacterias gram positivas podr谩n soportar este proceso gracias a su gran capa de peptidoglicano. No obstante, las bacterias Gram negativas no aguantar谩n este tratamiento con alcohol, por lo que se quitar谩 el cristal violeta de ellas.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, c茅lulas bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se a帽ade agua destilada.
  2. El proceso de fijaci贸n se realiza por calor a la llama.
  3. Se a帽ade cristal violeta, recubriendo con este colorante el portaobjetos durante 2 o 3 minutos.
  4. Ahora se a帽ade lugol (yoduro pot谩sico 2% + yodo) durante 1 minuto. El lugol no es un colorante en s铆, sino que hace de mordiente. El mordiente se acopla con el colorante y facilita su absorci贸n por parte del microorganismo.
  5. Se lava el portaobjetos con agua destilada. El agua no debe tocar directamente la muestra.
  6. Decolorado con alcohol 96%. Se a帽ade el alcohol gota a gota, y de la muestra saldr谩n gotas viol谩ceas. Paramos de a帽adir alcohol cuando salga la primera gota transparente de la muestra.
  7. Se a帽ade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.
  8. Por 煤ltimo se lava el portaobjetos y se seca.

Utilidades

La principal utilidad de la tinci贸n de Gram es la de distinguir entre bacterias gram positivas y negativas. Las gram negativas que perdieron coloraci贸n por el tratamiento con alcohol ahora se ver谩n de color rojo, naranja o ros谩ceo por acci贸n de la safranina. Por otra parte, las bacterias gram positivas te帽idas con cristal violeta tendr谩n un color azulado o viol谩ceo.

Gram positivas

Las siguientes especies son las gram positivas m谩s representativas:

Staphylococus aureus - Tinci贸n de Gram
Visi贸n de Staphylococus aureus con la tinci贸n de Gram. Podemos observar que forman racimos, pero su forma es irregular, y los grupos pueden ser de diversa morfolog铆a. Fuente: Dr. Richard Facklam (CDC)
Listeria monocytogenes - Tinci贸n de Gram
Visi贸n de Listeria monocytogenes con la tinci贸n de Gram. Se puede observar que es un cocobacilo alargado que suele agruparse formando cadenas. Fuente: Z煤帽iga et. al., 2011 (Elsevier)
Streptococcus pneumoniae - Tincion de Gram
Visi贸n de Streptococcus pneumoniae con la tinci贸n de Gram.Se pueden observar cocos agrupados en cadenas o en parejas. Fuente: Arnold Kaufman (CDC)
Corynebacterium striatum - Tinci贸n de Gram
Visi贸n de Corynebacterium striatum con la tinci贸n de Gram. Se apreciar bacilos alargados o ligeramente curvados, caracter铆sticos del g茅nero Corynebacterium. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)
Bacillus anthracis - Tinci贸n de Gram
Visi贸n de Bacillus anthracis con la tinci贸n de Gram. Podemos ver como est谩 organizada en largas hebras filamentosas. Para ver las endosporas que forman es necesaria otra tinci贸n que veremos m谩s adelante. Fuente: Dr. Brodsky (CDC)

Quiz谩 eches de menos a Mycobacterium tuberculosis. Es cierto, que es una bacteria gram positiva. No obstante, no se detecta bien con la tinci贸n de gram. Hace falta otra tinci贸n diferencial (tinci贸n de Ziehl-Neelsen) que veremos m谩s adelante.

Gram negativas

A continuaci贸n veremos algunas de las bacterias gram negativas m谩s comunes:

Escherichia coli - Tinci贸n de Gram
Escherichia coli y Staphylococcus aureus con la tinci贸n de Gram. Podemos ver los cocos azules gram positivos (S. aureus) y los bacilos gram negativos que representan a E. coli. Fuente: Y tambe, CC BY-SA 3.0 https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0, via Wikimedia Commons
Neisseria gonorrhoeae - Tinci贸n de Gram
Neisseria gonorrhoeae con la tinci贸n de Gram. Podemos ver que su morfolof铆a es de coco, y que suelen agruparse en diplococos. Fuente: Renelle Woodall (CDC)
Legionella pneumophila - Tinci贸n de Gram
Legionella pneumophila con la tinci贸n de Gram. Fuente: CDC
Pseudomonas aeruginosa - Tinci贸n de Gram
Pseudomonas aeruginosa con la tinci贸n de Gram. Aparecen como bacilos alargados. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)
Acinetobacter baumannii - Tinci贸n de Gram
Acinetobacter baumannii con la tinci贸n de Gram. A primera vista puede parecer m谩s azulado, aunque si nos fijamos m谩s, podemos ver como las bacterias aparecen de color rosado. Fuente: @mICROBIOsh (Twitter)

Recordatorio: las bacterias gram positivas se ti帽en de azul (azul oscuro o violeta), mientras que las bacterias gram negativas se ti帽en de rojo (rojo, anaranjado o rosado). A lo mejor lo tienes claro; pero en mi caso personal casi siempre las confund铆a. Por eso he puesto el color respectivo en cada frase, para que lo recuerdes mejor si te pasa igual que me pasaba a m铆. 馃槈

Tinci贸n Ziehl-Neelsen

La tinci贸n de Ziehl-Neelsen es de tipo diferencial, y sirve para detectar bacterias 谩cido-alcohol resistentes (BAAR), siendo la m谩s destacada Mycobacterium tuberculosis. Esto es muy 煤til, sobre todo teniendo en cuenta que M. tuberculosis no puede ser detectada correctamente con la tinci贸n de Gram.

Lo que hace diferentes a estas bacterias es la presencia de un pol铆mero (谩cidos mic贸licos) que se une a az煤cares, lo que provoca que el conjunto de la pared sea muy impermeable.

Colorantes

  • Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.
  • Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.

En la tinci贸n de Ziehl-Neelsen, el alcohol-谩cido cumple la una funci贸n parecida a la del alcohol 96% en la tinci贸n de Gram. En este caso, el contraste aparece por los 谩cidos mic贸licos, que hacen que sus bacterias sean impermeables al alcohol-谩cido. Las bacterias que no cuenten con estos 谩cidos mic贸licos se decolorar谩n por acci贸n del alcohol, y la fucsina saldr谩 de 茅stos.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, c茅lulas bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se a帽ade agua destilada.
  2. Se fija la muestra con calor.
  3. Se a帽ade fucsina fenicada, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 3 minutos.
  4. M谩s tarde, se pasa el mechero varias veces, durante 5 minutos, pero sin permitir que hierva el colorante, ni que se seque, ya que sino el colorante se consume.
  5. El exceso de colorante se quita con agua destilada.
  6. Se a帽ade alcohol-谩cido para la decoloraci贸n durante 10 minutos a intervalos de 1 minuto y medio.
  7. Ahora se a帽ade el colorante de contraste, el azul de metileno, durante 3 minutos.
  8. Por 煤ltimo, se lava el portaobjetos y se seca al aire.

Utilidades

La principal funci贸n de la tinci贸n de Ziehl-Neelsen es la detecci贸n de micobacterias, tales como las provocadoras de tuberculosis (M. tuberculosis) o la lepra (M. leprae). Tambi茅n hay otras micobacterias que, si bien no son pat贸genas, s铆 que pueden ser pat贸genos oportunistas en determinadas circunstancias.

Mycobacterium tuberculosis - Tinci贸n de Ziehl-Neelsen
Visi贸n de Mycobacterium tuberculosis (bacilos rojizos) con la tinci贸n de Ziehl-Neelsen en un n贸dulo linf谩tico. Fuente: Dr. Edwin P. Ewing, Jr. (CDC)

Adem谩s, se pueden detectar corinebacterias de gran inter茅s para la biotecnolog铆a por su producci贸n de aditivos, o a Streptomyces, formadora de diversos antibi贸ticos. Nocardia y Actinomices tambi茅n pueden aparecen como bacterias 谩cido-alcohol resistentes.

Las c茅lulas bacterianas te帽idas con fucsina aparecer谩n con un color rojo fuego, mientras que las te帽idas con azul de metileno tendr谩n un color azulado.

Tinci贸n de Wirtz-Conklin

La tinci贸n de Wirtz-Conklin se usa para observar bien las endosporas bacterianas. La muestra debe ser obtenida de un cultivo en fase estacionaria. En este caso, para su observaci贸n al microscopio hay que usar la lente x100, usando aceite de inmersi贸n.

Entra en el grupo de las tinciones selectivas, aunque al a帽adir un colorante de contraste es tecnicamente una tinci贸n diferencial.

Colorantes

  • Verde malaquita. Ti帽e las endosporas de verde.
  • Safranina. Es opcional, y sirve para colorear el resto de la c茅lula con un color anaranjado.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, c茅lulas bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se a帽ade agua destilada.
  2. Se fija la muestra con calor.
  3. Se a帽ade verde malaquita, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 9 minutos.
  4. Ahora se aplica calor de 3 a 6 minutos para que el colorante entre en las paredes de la endospora. El calor es aplicado hasta que aparezcan emisi贸n de vapores.
  5. Se lava con agua el portaobjetos para retirar el colorante de la c茅lula (a excepci贸n de las endosporas).
  6. Ahora se a帽ade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.
  7. Por 煤ltimo, se lava con agua y se seca el portaobjetos.

Utilidades

Se usa para observan las endosporas bacterianas, estructuras de resistencia que forman algunas bacterias para sobrevivir en condicione ambientales extremas donde no pueden hacer su ciclo de vida normal. As铆, se pueden ver las endosporas que forman Bacillus anthracis y Clostridium perfringens, entre otros.

Las endosporas no absorben la mayor铆a de los colorantes debido a sus cubiertas gruesas e impermeables. No obstante, el verde malaquita puede hacerlo, por lo que las endosporas bacterianas quedar谩n te帽idas de verde mientras que el resto de las c茅lulas bacterianas tendr谩n un color ros谩ceo.

Endosporas de Bacillus subtilis
Endosporas de Bacillus subtilis coloreadas en verde, mientras que el resto de las c茅lulas bacterianas son de color ros谩ceo. Fuente: De Y tambe (original uploader) - Trabajo propio, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=49530

Tinci贸n de Leifson

La tinci贸n de Leifson usa para la observaci贸n de flagelos bacterianos; entra dentro de las tinciones selectivas. Tienen un espesor de 0.01 micrones, por lo que son invisibles al microscopio 贸ptico; por ello hace falta esta t茅cnica especial. Para su observaci贸n en el microscopio 贸ptico, se debe usar aceite de inmersi贸n y el aumento 100x.

Recalcamos el hecho de esta tinci贸n se usa para ver flagelos bacterianos; los flagelos de organismos eucariotas son m谩s gruesos y pueden verse con tinciones simples o incluso con preparaciones al fresco.

Colorantes

Se usa el colorante de Leifson que est谩 formado por:

  • Fucsina b谩sica 95%. Es el colorante en s铆 mismo.
  • Etanol 1.2%.
  • 脕cido t谩nico 3%. Tiene funci贸n de mordiente.
  • Cloruro s贸dico 1.5%.
  • Agua destilada. Aparece en uni贸n a 谩cido t谩nico y cloruro s贸dico, formando parte de sus soluciones.

Las estructuras te帽idas aparecen con color rojizo.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, c茅lulas bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se a帽ade agua destilada. (Previamente se debe haber hecho un c铆rculo en el portaobjetos).
  2. El proceso de fijaci贸n se realiza sin llama durante 5 minutos. No se usa el mechero ya que demasiado calor puede destruir los flagelos.
  3. Se a帽aden unas gotas del colorante de Leifson y se espera 15 minutos.
  4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades

Esta tinci贸n se usa para ver a los flagelos, algo esencial para identificar muchas especies. Y es que los flagelos pueden aparecen en n煤mero y disposici贸n diferente en las bacterias, de ah铆 que sean una forma de clasificaci贸n de estas (para ver los tipos de bacterias seg煤n el n煤mero y disposici贸n de flagelos puedes entrar en el art铆culo de la c茅lula procariota, en la secci贸n 鈥渇lagelo鈥).

Flagelos de Bacillus con tinci贸n de Leifson
Flagelos de diversas especies de Bacillus con la tinci贸n de Leifson. Usando la tinci贸n de Gram no se podr铆an ver dichos flagelos, de ah铆 la necesidad de usar esta alternativa. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)

Tinci贸n de Giemsa

Esta tinci贸n es m谩s usada en citolog铆a, ya que puede discriminar entre zonas con altos contenidos de ADN, por lo que puede diferenciar diversos org谩nulos de la c茅lula; es una tinci贸n diferencial. No obstante, tambi茅n se usa en microbiolog铆a para la detecci贸n de ciertas bacterias, destacando Rickettsia.

Colorantes

Colorante de Giemsa. Da un color azul oscuro o viol谩ceo al microorganismo objetivo.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, c茅lulas bacterianas), y se extienden por el portaobjetos.
  2. El proceso de fijaci贸n se realiza con metanol durante 3 o 5 minutos.
  3. Se a帽aden unas el colorante de Giemsa y se espera 8 minutos.
  4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades

En microbiolog铆a, la tinci贸n de Giemsa detecta a bacterias como Rickettsia y Chlamydia, a protistas como Plasmodium y Pneumocystis, y ciertos hongos, como Histoplasma. Dichos microorganismos se detectan en posibles c茅lulas infectadas.

Plasmodium malariae - Tinci贸n de Giemsa
Visi贸n de Plasmodium malariae con la tinci贸n de Giemsa (azul oscuro). Se pueden ver hasta 8 merozoitos dentro de la c茅lula infectada. Fuente: Dr. Mae Melvin (CDC)

Otro pat贸geno importante que detecta la tinci贸n de Giemsa es Helicobacter pylori, causante de gastritis y 煤lceras.

Helicobacter pylori - Tinci贸n de Giemsa
Presencia de Helicobacter pylori (bacterias con forma de espirilo) con tinci贸n de Giemsa en una bioscopia g谩strica. Fuente: Ed Uthman from Houston, TX, USA, CC BY 2.0 https://creativecommons.org/licenses/by/2.0, via Wikimedia Commons

No obstante, esta tinci贸n es m谩s usada en citolog铆a.

Tinci贸n negativa

Se usa para detectar las c谩psulas que aparecen en algunas bacterias, as铆 que entra en el grupo de las tinciones selectivas. La tinci贸n negativa se puede usar para el microscopio 贸ptico o para el microscopio electr贸nico.

Esta t茅cnica se basa en contrastar las muestras mediante una sustancia opaca en ambos microscopios. Ahora bien, para el microscopio 贸ptico se contrasta la muestra a los fotones, mientras que en el microscopio electr贸nico se constrasta la muestra a los electrones.

Colorantes

Para el microscopio 贸ptico, principalmente pueden ser dos:

  • Tinta china.
  • Nigrosina.

Ti帽en el fondo de negro.

Preparaci贸n

El proceso de tinci贸n consta de los siguientes pasos:

  1. Se hace una preparaci贸n en fresco de la muestra.
  2. Ahora se a帽ade tinta china.
  3. Ya se puede observar

Si, de todas las tinciones, es el proceso m谩s corto que hemos visto.

Utilidades

La principal funci贸n de la tinci贸n negativa es observar las c谩psulas bacterianas. Esto ocurre porque las c谩psulas no absorben la tinta china, por lo que estas estructuras aparecen como zonas claras en un fondo negro, oscuro.

Cryptococcus neoformans - tinci贸n negativa con tinta china.
Visi贸n de las c谩psulas de Cryptococcus neoformans en el microscopio 贸ptico con tinci贸n negativa (tinta china). Fuente: Dr. Leanor Haley (CDC)

Ahora bien, se pueden a帽adir alg煤n colorante de contraste para que las c茅lulas bacterianas sean m谩s visibles. Y, como ya hemos dicho, se puede usar nigrosina en vez de tinta china.

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