🔬 Tinciones y Colorantes principales 🔬

Tinciones y colorantes principales en microbiología

Tras ver la teoría sobre colorantes y tinciones vamos a analizar las principales tinciones usadas en microbiología y los colorantes que las forman.

En este caso, las diferentes técnicas de tinción analizadas se usan para el microscopio óptico. La mayoría de las muestras se podrán ver en el microscopio con aumentos de 20x y 50x, aunque habrán casos donde será necesario usar el aumento 100x (donde se añade también el aceite de inmersión a la muestra).

Las tinciones principales son la de Gram y de Ziehl-Neelsen, ambas diferenciales; aunque también hay otras tinciones diferenciales y selectivas de interés para la microbiología.

Recordatorio: antes de leer este artículo sería bueno que conozcas un poco de teoría sobre las fases, mecanismos y tipos de tinciones que hay (además de las partes que tienen los colorantes). Si conoces todo esto podrás entender mejor ciertas expresiones que son más del gremio 😄.

Tinción de Gram

La tinción de Gram es probablemente la más conocida; es de tipo diferencial y sirve para distinguir a los microorganismos por morfología y composición.

Hay que tener en cuenta que se debe hacer la tinción cuando el cultivo esta en fase exponencial, ya que en fase estacionaria (“vejez”) se pueden confundir las gram positivas con las negativas. Esto ocurre debido a la perdida de capas de peptidoglicano por parte de bacterias gram positivas.

Colorantes

  • Cristal violeta. Da color azul o violáceo a las bacterias gram positivas.
  • Safranina. Da color rojizo o anaranajado a las bacterias gram negativas.

Aparte de estos colorantes, en la tinción de Gram se usará el lugol como mordiente, y alcohol 96% para decolorar. Todas las células (sean Gram positivas o negativas) se teñirán con el cristal violeta.

Kits tinción Gram
Así lucen los compuestos de las tinciones: en este caso, este es el kit de los compuestos necesarios para la tinción de Gram. Fuente: Fisher Scientific

Ahora bien, el alcohol quita fosfolípidos y cierra los poros de la pared celular, por lo que el cristal violeta queda atrapado. Las bacterias gram positivas podrán soportar este proceso gracias a su gran capa de peptidoglicano. No obstante, las bacterias Gram negativas no aguantarán este tratamiento con alcohol, por lo que se quitará el cristal violeta de ellas.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.
  2. El proceso de fijación se realiza por calor a la llama.
  3. Se añade cristal violeta, recubriendo con este colorante el portaobjetos durante 2 o 3 minutos.
  4. Ahora se añade lugol (yoduro potásico 2% + yodo) durante 1 minuto. El lugol no es un colorante en sí, sino que hace de mordiente. El mordiente se acopla con el colorante y facilita su absorción por parte del microorganismo.
  5. Se lava el portaobjetos con agua destilada. El agua no debe tocar directamente la muestra.
  6. Decolorado con alcohol 96%. Se añade el alcohol gota a gota, y de la muestra saldrán gotas violáceas. Paramos de añadir alcohol cuando salga la primera gota transparente de la muestra.
  7. Se añade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.
  8. Por último se lava el portaobjetos y se seca.

Utilidades

La principal utilidad de la tinción de Gram es la de distinguir entre bacterias gram positivas y negativas. Las gram negativas que perdieron coloración por el tratamiento con alcohol ahora se verán de color rojo, naranja o rosáceo por acción de la safranina. Por otra parte, las bacterias gram positivas teñidas con cristal violeta tendrán un color azulado o violáceo.

Gram positivas

Las siguientes especies son las gram positivas más representativas:

Staphylococus aureus - Tinción de Gram
Visión de Staphylococus aureus con la tinción de Gram. Podemos observar que forman racimos, pero su forma es irregular, y los grupos pueden ser de diversa morfología. Fuente: Dr. Richard Facklam (CDC)
Listeria monocytogenes - Tinción de Gram
Visión de Listeria monocytogenes con la tinción de Gram. Se puede observar que es un cocobacilo alargado que suele agruparse formando cadenas. Fuente: Zúñiga et. al., 2011 (Elsevier)
Streptococcus pneumoniae - Tincion de Gram
Visión de Streptococcus pneumoniae con la tinción de Gram.Se pueden observar cocos agrupados en cadenas o en parejas. Fuente: Arnold Kaufman (CDC)
Corynebacterium striatum - Tinción de Gram
Visión de Corynebacterium striatum con la tinción de Gram. Se apreciar bacilos alargados o ligeramente curvados, característicos del género Corynebacterium. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)
Bacillus anthracis - Tinción de Gram
Visión de Bacillus anthracis con la tinción de Gram. Podemos ver como está organizada en largas hebras filamentosas. Para ver las endosporas que forman es necesaria otra tinción que veremos más adelante. Fuente: Dr. Brodsky (CDC)

Quizá eches de menos a Mycobacterium tuberculosis. Es cierto, que es una bacteria gram positiva. No obstante, no se detecta bien con la tinción de gram. Hace falta otra tinción diferencial (tinción de Ziehl-Neelsen) que veremos más adelante.

Gram negativas

A continuación veremos algunas de las bacterias gram negativas más comunes:

Escherichia coli - Tinción de Gram
Escherichia coli y Staphylococcus aureus con la tinción de Gram. Podemos ver los cocos azules gram positivos (S. aureus) y los bacilos gram negativos que representan a E. coli. Fuente: Y tambe, CC BY-SA 3.0 https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0, via Wikimedia Commons
Neisseria gonorrhoeae - Tinción de Gram
Neisseria gonorrhoeae con la tinción de Gram. Podemos ver que su morfolofía es de coco, y que suelen agruparse en diplococos. Fuente: Renelle Woodall (CDC)
Legionella pneumophila - Tinción de Gram
Legionella pneumophila con la tinción de Gram. Fuente: CDC
Pseudomonas aeruginosa - Tinción de Gram
Pseudomonas aeruginosa con la tinción de Gram. Aparecen como bacilos alargados. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)
Acinetobacter baumannii - Tinción de Gram
Acinetobacter baumannii con la tinción de Gram. A primera vista puede parecer más azulado, aunque si nos fijamos más, podemos ver como las bacterias aparecen de color rosado. Fuente: @mICROBIOsh (Twitter)

Recordatorio: las bacterias gram positivas se tiñen de azul (azul oscuro o violeta), mientras que las bacterias gram negativas se tiñen de rojo (rojo, anaranjado o rosado). A lo mejor lo tienes claro; pero en mi caso personal casi siempre las confundía. Por eso he puesto el color respectivo en cada frase, para que lo recuerdes mejor si te pasa igual que me pasaba a mí. 😉

Tinción Ziehl-Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen es de tipo diferencial, y sirve para detectar bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), siendo la más destacada Mycobacterium tuberculosis. Esto es muy útil, sobre todo teniendo en cuenta que M. tuberculosis no puede ser detectada correctamente con la tinción de Gram.

Lo que hace diferentes a estas bacterias es la presencia de un polímero (ácidos micólicos) que se une a azúcares, lo que provoca que el conjunto de la pared sea muy impermeable.

Colorantes

  • Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.
  • Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.

En la tinción de Ziehl-Neelsen, el alcohol-ácido cumple la una función parecida a la del alcohol 96% en la tinción de Gram. En este caso, el contraste aparece por los ácidos micólicos, que hacen que sus bacterias sean impermeables al alcohol-ácido. Las bacterias que no cuenten con estos ácidos micólicos se decolorarán por acción del alcohol, y la fucsina saldrá de éstos.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.
  2. Se fija la muestra con calor.
  3. Se añade fucsina fenicada, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 3 minutos.
  4. Más tarde, se pasa el mechero varias veces, durante 5 minutos, pero sin permitir que hierva el colorante, ni que se seque, ya que sino el colorante se consume.
  5. El exceso de colorante se quita con agua destilada.
  6. Se añade alcohol-ácido para la decoloración durante 10 minutos a intervalos de 1 minuto y medio.
  7. Ahora se añade el colorante de contraste, el azul de metileno, durante 3 minutos.
  8. Por último, se lava el portaobjetos y se seca al aire.

Utilidades

La principal función de la tinción de Ziehl-Neelsen es la detección de micobacterias, tales como las provocadoras de tuberculosis (M. tuberculosis) o la lepra (M. leprae). También hay otras micobacterias que, si bien no son patógenas, sí que pueden ser patógenos oportunistas en determinadas circunstancias.

Mycobacterium tuberculosis - Tinción de Ziehl-Neelsen
Visión de Mycobacterium tuberculosis (bacilos rojizos) con la tinción de Ziehl-Neelsen en un nódulo linfático. Fuente: Dr. Edwin P. Ewing, Jr. (CDC)

Además, se pueden detectar corinebacterias de gran interés para la biotecnología por su producción de aditivos, o a Streptomyces, formadora de diversos antibióticos. Nocardia y Actinomices también pueden aparecen como bacterias ácido-alcohol resistentes.

Las células bacterianas teñidas con fucsina aparecerán con un color rojo fuego, mientras que las teñidas con azul de metileno tendrán un color azulado.

Tinción de Wirtz-Conklin

La tinción de Wirtz-Conklin se usa para observar bien las endosporas bacterianas. La muestra debe ser obtenida de un cultivo en fase estacionaria. En este caso, para su observación al microscopio hay que usar la lente x100, usando aceite de inmersión.

Entra en el grupo de las tinciones selectivas, aunque al añadir un colorante de contraste es tecnicamente una tinción diferencial.

Colorantes

  • Verde malaquita. Tiñe las endosporas de verde.
  • Safranina. Es opcional, y sirve para colorear el resto de la célula con un color anaranjado.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.
  2. Se fija la muestra con calor.
  3. Se añade verde malaquita, cubriendo totalmente el portaobjetos durante 9 minutos.
  4. Ahora se aplica calor de 3 a 6 minutos para que el colorante entre en las paredes de la endospora. El calor es aplicado hasta que aparezcan emisión de vapores.
  5. Se lava con agua el portaobjetos para retirar el colorante de la célula (a excepción de las endosporas).
  6. Ahora se añade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.
  7. Por último, se lava con agua y se seca el portaobjetos.

Utilidades

Se usa para observan las endosporas bacterianas, estructuras de resistencia que forman algunas bacterias para sobrevivir en condicione ambientales extremas donde no pueden hacer su ciclo de vida normal. Así, se pueden ver las endosporas que forman Bacillus anthracis y Clostridium perfringens, entre otros.

Las endosporas no absorben la mayoría de los colorantes debido a sus cubiertas gruesas e impermeables. No obstante, el verde malaquita puede hacerlo, por lo que las endosporas bacterianas quedarán teñidas de verde mientras que el resto de las células bacterianas tendrán un color rosáceo.

Endosporas de Bacillus subtilis
Endosporas de Bacillus subtilis coloreadas en verde, mientras que el resto de las células bacterianas son de color rosáceo. Fuente: De Y tambe (original uploader) - Trabajo propio, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=49530

Tinción de Leifson

La tinción de Leifson usa para la observación de flagelos bacterianos; entra dentro de las tinciones selectivas. Tienen un espesor de 0.01 micrones, por lo que son invisibles al microscopio óptico; por ello hace falta esta técnica especial. Para su observación en el microscopio óptico, se debe usar aceite de inmersión y el aumento 100x.

Recalcamos el hecho de esta tinción se usa para ver flagelos bacterianos; los flagelos de organismos eucariotas son más gruesos y pueden verse con tinciones simples o incluso con preparaciones al fresco.

Colorantes

Se usa el colorante de Leifson que está formado por:

  • Fucsina básica 95%. Es el colorante en sí mismo.
  • Etanol 1.2%.
  • Ácido tánico 3%. Tiene función de mordiente.
  • Cloruro sódico 1.5%.
  • Agua destilada. Aparece en unión a ácido tánico y cloruro sódico, formando parte de sus soluciones.

Las estructuras teñidas aparecen con color rojizo.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada. (Previamente se debe haber hecho un círculo en el portaobjetos).
  2. El proceso de fijación se realiza sin llama durante 5 minutos. No se usa el mechero ya que demasiado calor puede destruir los flagelos.
  3. Se añaden unas gotas del colorante de Leifson y se espera 15 minutos.
  4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades

Esta tinción se usa para ver a los flagelos, algo esencial para identificar muchas especies. Y es que los flagelos pueden aparecen en número y disposición diferente en las bacterias, de ahí que sean una forma de clasificación de estas (para ver los tipos de bacterias según el número y disposición de flagelos puedes entrar en el artículo de la célula procariota, en la sección “flagelo”).

Flagelos de Bacillus con tinción de Leifson
Flagelos de diversas especies de Bacillus con la tinción de Leifson. Usando la tinción de Gram no se podrían ver dichos flagelos, de ahí la necesidad de usar esta alternativa. Fuente: Dr. W.A. Clark (CDC)

Tinción de Giemsa

Esta tinción es más usada en citología, ya que puede discriminar entre zonas con altos contenidos de ADN, por lo que puede diferenciar diversos orgánulos de la célula; es una tinción diferencial. No obstante, también se usa en microbiología para la detección de ciertas bacterias, destacando Rickettsia.

Colorantes

Colorante de Giemsa. Da un color azul oscuro o violáceo al microorganismo objetivo.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se extienden por el portaobjetos.
  2. El proceso de fijación se realiza con metanol durante 3 o 5 minutos.
  3. Se añaden unas el colorante de Giemsa y se espera 8 minutos.
  4. Ahora se lava el portaobjetos con agua destilada y se seca

Utilidades

En microbiología, la tinción de Giemsa detecta a bacterias como Rickettsia y Chlamydia, a protistas como Plasmodium y Pneumocystis, y ciertos hongos, como Histoplasma. Dichos microorganismos se detectan en posibles células infectadas.

Plasmodium malariae - Tinción de Giemsa
Visión de Plasmodium malariae con la tinción de Giemsa (azul oscuro). Se pueden ver hasta 8 merozoitos dentro de la célula infectada. Fuente: Dr. Mae Melvin (CDC)

Otro patógeno importante que detecta la tinción de Giemsa es Helicobacter pylori, causante de gastritis y úlceras.

Helicobacter pylori - Tinción de Giemsa
Presencia de Helicobacter pylori (bacterias con forma de espirilo) con tinción de Giemsa en una bioscopia gástrica. Fuente: Ed Uthman from Houston, TX, USA, CC BY 2.0 https://creativecommons.org/licenses/by/2.0, via Wikimedia Commons

No obstante, esta tinción es más usada en citología.

Tinción negativa

Se usa para detectar las cápsulas que aparecen en algunas bacterias, así que entra en el grupo de las tinciones selectivas. La tinción negativa se puede usar para el microscopio óptico o para el microscopio electrónico.

Esta técnica se basa en contrastar las muestras mediante una sustancia opaca en ambos microscopios. Ahora bien, para el microscopio óptico se contrasta la muestra a los fotones, mientras que en el microscopio electrónico se constrasta la muestra a los electrones.

Colorantes

Para el microscopio óptico, principalmente pueden ser dos:

  • Tinta china.
  • Nigrosina.

Tiñen el fondo de negro.

Preparación

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

  1. Se hace una preparación en fresco de la muestra.
  2. Ahora se añade tinta china.
  3. Ya se puede observar

Si, de todas las tinciones, es el proceso más corto que hemos visto.

Utilidades

La principal función de la tinción negativa es observar las cápsulas bacterianas. Esto ocurre porque las cápsulas no absorben la tinta china, por lo que estas estructuras aparecen como zonas claras en un fondo negro, oscuro.

Cryptococcus neoformans - tinción negativa con tinta china.
Visión de las cápsulas de Cryptococcus neoformans en el microscopio óptico con tinción negativa (tinta china). Fuente: Dr. Leanor Haley (CDC)

Ahora bien, se pueden añadir algún colorante de contraste para que las células bacterianas sean más visibles. Y, como ya hemos dicho, se puede usar nigrosina en vez de tinta china.

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