Nutrición microbiana. Medios de Cultivo

Aunque la célula procariota tenga sus diferencias con la eucariota, estos microorganismos necesitan, como todos los seres vivos, una serie de alimentos o nutrientes para poder crecer. Conocer la nutrición microbiana nos será útil para desarrollar su crecimiento in vitro mediante los medios de cultivo (en el laboratorio).

Los nutrientes son compuestos químicos empleados para la biosíntesis y producción de energía. En el caso de los medios de cultivo, se administran en cantidades apropiadas para nuestro cultivo objetivo. Hay una mezcla compensada donde aparecen los nutrientes esenciales. Necesitan los siguientes compuestos.

Nutrientes necesarios para los microorganismos

• Macronutrientes. Son la gran mayoría de los requerimientos nutricionales del microorganismo (95%). Se expresan en g/l. Sirven para sintetizar la mayor parte de los componentes principales de la célula. Son el:
  • Carbono. Según su fuente de carbono los seres vivos pueden ser autótrofos o heterótrofos, pero eso lo analizaremos más tarde. No hay ninguna molécula orgánica natural que no pueda ser utilizada por algún microorganismo (actinomicetos, Burkholderia). También hay organismos muy exigentes que solo pueden catabolizar algunos compuestos de carbono, como Leptospira o las bacterias metanótrofas.
  • Nitrógeno. El nitrógeno es esencial para la formación de proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares. La mayor parte disponible aparece en forma inorgánica (NH₃, NO₃^-, N₂). La mayoría usa NH₃ como una única fuente de nitrógeno, si bien otros usan NO₃^-, y las bacterias fijadoras de nitrógeno usan N₂.
  • Oxígeno. Es vital para los organismos aerobios. Ahora bien, los organismos anaerobios necesitan lo contrario, evitar el oxígeno. Para ello tienen diversos sistemas. Veremos esto más adelante.
  • Hidrógeno
  • Fósforo. Es necesario para los ácidos nucleicos y fosfolípidos, como el ATP. Pueden usar fosfatos orgánicos e inorgánicos, si bien la mayoría usa PO_4^3- inorgánico y lo incorpora directamente.
  • Azufre. Se usa para la formación de algunos aminoácidos, como cisteína y metionina, algunos carbohidratos, ciertas vitaminas y coenzimas (biotina, tiamina, conenzima A). La mayoría usa SO_4^2- y lo reduce (reducción asimilatoria de sulfato), aunque algunos necesitan una forma reducida de S.
  • También son esenciales el potasio (esencial en los transportes de membrana), calcio (para formar dipicolinato cálcico que da resistencia térmica a las endosporas), magnesio (cofactor de enzimas, formando complejos con ATP, además de estabilizar ribosomas y membranas celulares), sodio (para estabilizar la pared), hierro (esencial para la respiración celular, forma parte de citocromos en la bacterioclorofila, y es cofactor de enzimas y proteínas transportadoras de electrones) y cationes con distintas funciones pero en menos cantidad, que se expresan en mg/l.
    • El hierro puede ser reducido de Fe³⁺ a Fe²⁺ por algunos microbios, formando sideróforos: agentes quelantes de hierro. De esta forma el hierro puede ser asimilado por los mecanimos de transporte activo. Son esenciales para iniciar la infección en muchas bacterias patógenas.
• Micronutrientes. En cantidades pequeñas. Se expresa en mg/l. Son generalmente cationes de cobalto, zinc, cobre, molibdeno (en las enzimas nitrogenasas) y níquel (es un cofactor). Suelen estar en los centros activos de algunas enzimas. El cobalto y el zinc se usan en muchas enzimas y proteínas.
• Factores de crecimiento. Son aquellos factores que los microorganismos no pueden sintetizar, como aminoácidos, vitaminas o bases nitrogenadas especificas (pirimidinas y purinas para formar ácidos nucleicos). Por ejemplo, la mayor parte de las bacterias lácticas tienen su capacidad biosintética muy reducida y tienen que tomar las moléculas pre-sintetizadas.
• Agua. Está en todos los seres vivos, ya que estamos constituidos por agua en la mayor parte de nuestro cuerpo. Además, en todos los seres vivos, las reacciones del metabolismo se llevan a cabo en un medio acuoso.

Grupos tróficos

En base a los requerimientos nutritivos se establecen una serie de categorías que tienen como consideración principal la fuente de energía, a través del cual el microorganismo satisface todas sus necesidades, y la fuente de carbono.

• Respecto de la fuente de energía tenemos dos fuentes principales: los que usan la luz solar y la convierten en energía química (fotótrofos o comedores de luz), y aquellos que dependen de sustancias químicas (quimiótrofos).
• Respecto a la fuente de carbono: los que usan el CO₂, que deben reducirlo (autótrofos), y aquellos que dependen de compuestos orgánicos preformados y reducidos, que no pueden fijar CO₂ (heterótrofos).

Según estos requerimientos nutricionales, los microorganismos se pueden dividir en:

• Fotoautótrofos. Plantas, algas, cianobacterias. El poder reductor para pasar de CO₂ a carbono libre lo suministra el agua, por lo que este mecanismo fotoautotrófico (o fotosintético) desprenderá oxigeno. La luz es su fuente de energía.
• Fotoheterótrofos. Bacterias rojas y verdes (aunque no todas). En la mayoría de los casos el poder reductor para reducir el carbono orgánico lo dan moléculas reducidas como el hidrógeno, el ácido Sulfhídrico, entre otras; por lo que este proceso NO desprende oxigeno. También se les puede denominar fotoorganótrofos. La luz es su fuente de energía.
• Quimioautótrofos. No necesitan ninguna molécula orgánica. Se denominan coloquialmente quimiolitótrofos (o comedores de piedras): el mismo sustrato que oxidan les va a servir como fuente de poder reductor.
• Quimioheterótrofos. Prácticamente todos los seres vivos se incluyen aquí. También se les puede denominar quimioorganótrofos.

La distinción entre los distintos grupos no es tajante, no están separados por líneas totalmente definidas. Hay algunos microorganismos que son facultativos; por ejemplo, muchos quimioheterótrofos si no hay moléculas orgánicas en el medio tienen la capacidad de utilizar sales inorgánicas y oxidarlas, y algunos incluso pueden fijar CO₂.

Aparte de los comentados anteriormente, también aparecen los mixótrofos. Hay algunas especies (como Beggiatoa) que tienen un metabolismo mixto: pueden usar una sal como fuente de energía y una molécula orgánica como fuente de carbono.

Función del oxígeno en el metabolismo microbiano

En la atmósfera actual gran parte de la vida depende del oxigeno para vivir; pero igualmente el oxigeno es una sustancia tóxica (es oxidante para las células).            

Para que un organismo pueda crecer, su metabolismo (aerobio u oxidativo) depende de que al oxidarse la molécula inorgánica, los electrones son captados por una cadena de transporte de electrones al final de la cual hay un aceptor externo: si es oxígeno, que se reduce a agua, hablamos de una respiración aerobia, pero si no es oxígeno hablamos de respiración anaerobia.

Hay mecanismos de conservación de energía sin aceptores externos de electrones. Metabólicamente, la fermentación es un proceso de oxido-reducción interno en el cual no hay ninguna molécula externa que actúe como aceptor de electrones, sino que los productos que se obtienen de la oxidación están más o menos oxidados o reducidos.

En una respiración, hay un mecanismo de conservación de energía por medio de un proceso de transporte de energía con un aceptor final externo. En función de cuál sea su dependencia del oxigeno, los microorganismos se clasifican en:

• Aerobios obligados o estrictos. Requieren el oxígeno a la presión atmosférica para poder crecer. Su metabolismo es respiratorio (oxígeno como aceptor final).
• Anaerobios estrictos. Tienen que vivir siempre en ausencia de oxígeno y no pueden ni verlo porque la presencia de trazas de oxígeno es letal. O bien obtienen energía por fermentación generalmente o por respiración anaerobia.

Podemos aislarlos de ambientes donde haya oxigeno: en estos ambientes aparecen asociados a los facultativos. Los facultativos consumen el oxigeno que haya, crean un ambiente de anaerobiosis para que se desarrollen los estrictos. Esto ocurre en nuestro tracto digestivo, con el género Bacteroides, que solo es capaz de vivir en el tracto digestivo si E. coli ha creado un medio anaerobio.

• Anaerobios facultativos. Cuando hay oxigeno presente pueden respirar aeróbicamente, pero si no hay oxigeno pasan a un metabolismo fermentativo. Prefieren un medio con oxigeno para crecer porque el rendimiento aerobio es mucho mayor que el fermentativo.
• Microaerófilos. Hay organismos para los cuales la dosis de oxigeno a la presión atmosférica es muy fuerte y necesitan vivir a presiones parciales por debajo de la atmosférica (2-10%): si hay mucho oxigeno las enzimas y el metabolismo en general fallan y no funcionan bien.
• Anaerobios aerotolerantes. Viven en presencia de oxigeno pero no lo pueden utilizar, su metabolismo es siempre fermentativo pero toleran el oxigeno (como la mayor parte de las bacterias lácticas).

Defensas microbianas frente al oxígeno

El oxigeno tiene un par de electrones desapareados en el orbital externo que tienden a reaccionar.  El proceso de reducción del oxigeno a agua requiere cuatro electrones: en cada paso se van a formar las especies reactivas o radicales libres (con electrones desapareados).

Los más peligrosos son el anión superoxido (O₂^–), el radical hidroxilo (OH) y el peróxido de hidrogeno (H₂O₂). Estos radicales son unos reactivos muy fuertes que van a dañar proteínas, el ADN, etc. Esta es la razón por las cual las células los tienen que eliminar; para ello han desarrollado un conjunto de procesos antioxidantes. Algunos constituyentes celulares (como flavoproteínas, proteínas Fe-S, o grupos -SH, entre otros) promueven su reducción incompleta, y los convierten en ROS (formas reactivas de oxígeno). Vamos a hablar de los antioxidantes enzimáticos:

Catalasa

El peróxido de hidrogeno (sin e- desapareados) lo degrada a agua + oxigeno.                 

2 H₂O₂  → 2 H₂O + O₂

Nunca se encuentra catalasa en los anaerobios estrictos ya que hay desprendimiento de oxigeno. La catalasa es específica de aerobios o anaerobios facultativos.

Superoxido dismutasa (SOD)

O₂^– + O₂^– 2H⁺  → 2 H₂O₂ + O₂

Prácticamente todas las bacterias aerobias tienen estas dos enzimas y las anaerobias no tienen ninguna de las dos o las cantidades son tan ínfimas que no sirven.

Peroxidasa

En anaerobios estrictos. Acoplan la reducción del peróxido de hidrogeno utilizando un compuesto orgánico reductor (como el NADH) de tal manera que el peorsicod de hidrogeno se reduce a agua y el NADH se oxida a NAD-.

H₂O₂ + NADH + H⁺   → 2 H₂O + NAD⁺

Los aerotolerantes no tienen catalasa, algunas tienen SOD y otras peroxidasas especiales. Tambien aparecen algunas que neutralizan el anión superóxido utilizando el manganeso.

En la siguiente imagen se puede ver un resumen de todo lo comentado en esta sección.

Mecanismos de transporte en bacterias

La membrana plasmática es la estructura clave que dice qué pasa a la célula y qué sale de ella. Prácticamente va a dejar que entren muy pocas cosas a la célula por sí solas: ninguna molécula polar (con carga) va a poder pasar, incluyendo los protones (H⁺). Van a pasar moléculas muy pequeñitas, apolares, y algunas sustancias fuertemente hidrofóbicas que pueden solubilizarse en la bicapa lipídica de las membranas (p.ejemplo: el agua, algunos alcoholes y ácidos grasos de bajo número de carbonos). Las células deben desarrollar sistemas específicos de transporte:

• Difusión simple. Pueden cruzar la membrana las sustancias pequeñas y apolares, siempre que lo hagan a favor de gradiente de concentración: de una zona más concentrada a una zona más diluida. Tanto la velocidad como el nivel de entrada tienden a igualarse, a estabilizarse: a medida que la concentración interna aumenta, el proceso se para, pudiendo llegar a ser reversible. Es un paso libre de sustancias. No hay ningún mecanismo que ayude a las moléculas a atravesar la membrana.
• Difusión facilitada. En la membrana hay una serie de proteínas transmembranales, las proteasas, que capturan el sustrato a transportar y mediante un cambio conformacional lo liberan en el interior celular. Es un mecanismo de difusión porque también se realiza a favor de gradiente, aunque es un gradiente menos exigente que el de la difusión simple: no se requiere que la diferencia de concentraciones sea tan alta entre el exterior y el interior de la célula.

Cada permeasa va a transportar una o un grupo de moléculas que sean estructuralmente relacionables: las permeasas son muy específicas.

Este mecanismo de transporte es un mecanismo reversible: ocurre a favor de gradiente y si el gradiente se invierte, el sentido del transporte también. Las moléculas una vez transportadas no se acumulan, sino que son incluidas inmediatamente en el metabolismo.  

Mediante este mecanismo, que en principio tiene más importancia en eucariotas que en procariotas, se transporta el glicerol y algunos aminoácidos pequeños.

• Transporte activo. En la realidad la concentración de nutrientes en el medio suele ser baja, pero los microorganismos con esas condiciones tienen que crecer. Eso significa que tienen que transportar nutrientes hacia concentraciones más elevadas, es decir, en contra de gradiente: de un medio más diluido a un medio más concentrado. Para ello hay mecanismos de transporte activo. Estos mecanismos emplean permeasas específicas que unen y transportan sustancias muy concretas, pero el transporte requiere aporte de energía (en forma de ATP). En el caso de GRAM+ el ATP proviene del pool interno; en GRAM- de la fuerza protón-motriz.

La diferencia con la difusión facilitada es que en el transporte activo fuerza la entrada en contra de gradiente y se requiere gasto de ATP.

En los mecanismos de transporte activo la sustancia introducida se libera en el citoplasma celular tal y como estaba: no hay ninguna modificación química. Es  un mecanismo de transporte irreversible: lo que entra ya no puede volver a salir. Hay tres tipos de transporte activos:

• Uniporter. Una sola sustancia desde el medio al interior celular.
  • Simporter. Dos sustancias se cotransportan simultáneamente de fuera a dentro. Es un transporte interdependiente: el transporte de una va asociado al transporte de la otra. Ejemplo: transporte acoplado de lactosa por la enzima lactosa-permeasa con un protón. La lactosa se contransporta desde el medio junto con un protón. Es una reacción equimolecular. El protón se une a la enzima y cambia su especificidad haciendo que reconozca y se una con la lactosa. Si la bacteria no transporta el protón, tampoco transporta a la lactosa.
  • Antiporter. Dos sustancias son transportadas en sentidos inversos. Una entra y la otra sale. Ejemplo: bombeo que hace E. coli de sodio hacia el exterior simultáneamente con el transporte interno de protones. De esta manera se genera un gradiente externo de sodio que, al disiparse, se puede acoplar al transporte de varios azúcares (como la melibiosa, o el glutamato en E. coli). Se produce en enterobacterias y bacillus sobre todo.

Dentro del transporte activo hay una variante que es la llamada ‘’translocación de grupo’’. Es una variante de transporte activo en el cual se produce la modificación química del soluto transportado al exterior.  Normalmente consiste en una fosforilación.

El sistema más conocido es el de las fosfotransferasas (transferencia de grupos fosfato). El fosfato viene del fosfo-enol-piruvato (PTS), que cede su grupo fosfato a un azúcar, formando un azúcar fosfato + piruvato.

El componente clave del transporte se denomina ‘’enzima II’’: es una proteína transmembrana que es específica para el sustrato a transportar. La enzima II reconoce específicamente al sustrato. El mecanismo de fosforilación acoplado lo realizan elemento inespecíficos: la enzima I y el HPR (proteína estable al calor).

Inmediatamente que se transporta y se fosforila una sustancia la introducen en el metabolismo y la procesan, evitando así que se acumule y vuelva a salir de la célula.

Este sistema PTS está muy extendido entre bacterias anaerobias facultativas (enterobacterias y Stafilococcus) y entre anaerobios estrictos (Clostridium). Sin embargo, son muy raros en los aerobios estrictos.

Estos sistemas además de para la nutrición, son importantes como señales quimio-tácticas.

Transportadores ABC

Están presentes en los tres dominios (Bacteria, Arquea y Eukarya). El transportador como tal consta de una parte de dos regiones transmembranales insertadas en la membrana, otras dos regiones citosolicas de unión con ATP, y un tercer elemento (una proteína especifica de unión al sustrato que es bacterias GRAM- está situada en el espacio  periplásmico y en GRAM+ está en la superficie externa de la membrana plasmática). El resto de elementos son inespecíficos.

Una vez que la proteína de unión específica se une al sustrato se pone en contacto con el transportador y el gasto de ATP permite la entrada a la célula y la liberación de la sustancia sin ninguna modificación.

Se ha visto que muchas bacterias lo utilizan para bombear fuera sustancias nocivas para las células. Se ha visto también que, en eucariotas superiores, los sistemas ABC tienen una gran importancia en clínica. En muchos tumores las células tumorales evitan la acción de la quimioterapia bombeando al exterior los fármacos mediante el ABC. En la fibrosis quística se ha demostrado que la enfermedad puede derivar en una mutación en un transportador ABC que sirve como canal de iones cloro en los pulmones.

Medios de cultivo

A partir de los requerimientos nutricionales, los medios de transporte y toda la información que hemos anteriormente, estamos en condiciones de preparar medios de cultivo apropiados para cada tipo de microorganismo.

Un medio de cultivo es un sustrato nutritivo equilibrado que contiene todos los ingredientes necesarios para posibilitar el crecimiento de los microorganismos. Su elaboración es un requisito imprescindible para la obtención de un cultivo puro de microorganismos.

Vamos a clasificar a los medios de cultivo atendiendo a:

Composición química

Hay dos tipos:

• Sintéticos. Todos los componentes están presentes a una concentración fija y conocida de cada uno de ellos. Incorpora todo lo que necesita la bacteria para crecer en una composición definida.
• Complejos o ricos. Incluyen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento pero no podemos conocer la composición de cada uno de ellos, no conocemos su composición química. Los medios complejos van a permitir que los quimioheterótrofos puedan crecer.

Estado físico del medio

Pueden ser de varios tipos:

• Medios líquidos. Sin agar.
• Medios semisólidos. Entre un 0`5-1 % de agar. Tienen aspecto gelatinoso.
• Medios sólidos. Con 1`5-2`5 % de agar. Estos medios se trabajan sobre placas de petri.

Funcionalidad de los medios de cultivo

Los clasifica en base a sus propiedades concretas de crecimiento. Hay varios tipos:

• Medios selectivos. Medio base con todos los ingredientes al que se le adiciona algún componente especifico que inhibe el crecimiento de bacterias que no nos interesan, permitiendo el desarrollo SOLO de las bacterias que nos interesan. El medio de McConkey incorpora sales biliares, por lo que nos sirve para seleccionar GRAM-, inhibiendo a los GRAM+ que no crecen. Si queremos aislar GRAM+, incorporamos acida sódica o acetato de talio, que inhiben GRAM-.
• Medios diferenciales. En este caso el medio base no inhibe nada pero va a incorporar alguna sustancia que nos va a diferenciar a los microorganismos según sus propiedades y patrones de crecimiento. El medio agar-sangre: si entre lo que nosotros tenemos hay alguna bacteria capaz de lisar los hematíes los vamos a diferenciar del resto porque van a formar un halo de lisis. Un medio también se puede hacer diferencial añadiendo almidón: si alguna degrada el almidón, con vapores de iodo vamos a ver una coloración violácea, así las distinguimos del resto que también han crecido. ¿Puede un medio ser selectivo y diferencial a la vez? Si. Por ejemplo, el medio McConkey. Este medio ya es selectivo, por la presencia de sales biliares, pero además se hace diferencial al añadirle lactosa (aquellas bacterias coliformes capaces de degradar la lactosa nos dan una coloración rosa característica que el resto de bacterias que no la de degradan no pueden producir).
• Medios enriquecidos. El medio se enriquece añadiendo al medio base alguna vitamina/aminoácido/factor de crecimiento que va a ayudar al crecimiento de organismos  que o bien son minoritarios o bien son nutricionalmente exigentes y necesitan algún nutriente especial. No inhibe el crecimiento del resto de microorganismos.

Además de los posibles medios de cultivo, también se pueden añadir antibióticos para comprobar la sensibilidad, o resistencia, del patógeno en cuestión.

Técnicas para obtención de cultivos puros

Un cultivo puro es aquel que contiene una sola especie microbiana. Es una técnica esencial para estudiar los microorganismos.

Siembra en estría

El método más común para obtener un cultivo puro es:

• Tenemos una placa con un medio. Usando un asa de cultivo realizamos una serie de estrías en una zona de la capa, distribuyendo la carga microbiana que hemos tomado.
• A medida que hacemos las estrías la carga microbiana será menor.
• Esterilizamos el asa.
• Desde el último punto volvemos a hacer estría.
• A partir de ese último punto (el segundo) se hacen estrías de nuevo.

En las primeras estrías la carga microbiana es abundante y habrá crecimiento en masa a lo largo de ellas. Si hay crecimiento fuera de la estría es que hay contaminación.

A medida que avanzan las estrías aparecen colonias aisladas que aparecen de la división de una célula aislada. Cada colonia es un cultivo puro de microorganismos que proceden de un único individuo aislado.

Método del vertido en placa o siembra en profundidad.

• Tenemos un tubo con agar líquido a 40-45 ºC y se mezcla con la solución de microorganismos.
• Se vierte en una placa.
• Las células individuales formaran colonias aisladas que provienen cada una de una única célula.
• Cada una de esas colonias es un cultivo puro.

Diluciones seriadas

Es un método empírico introducido por Lister. A partir de la muestra compleja se hacen diluciones seriadas. En cada dilución se disminuye el número de células, hasta que lleguemos a una dilución con una única célula.

Micromanipulador

Permite la selección directa de una sola célula. Tenemos un microscopio especial al que hay adherido un dispositivo especial con una aguja. Se inspecciona la muestra y se selecciona una célula con el manipulador.

Es una técnica muy cara, por el equipamiento que se requiere. Además, se necesita una cierta pericia manual.

Mantenimiento y conservación de cultivos puros

Una vez que tenemos el cultivo puro formado, tenemos que caracterizarlos y ver que a lo largo del tiempo mantienen una identidad morfológica de las células individuales, de las colonias, una identidad bioquímica y fisiología (si se ha caracterizado una serie de enzimas concretas, tienen que mantener su identidad) y una vez que lo tenemos hay que intentar conservarlo.

Procedimientos de conservación:

• Aceite mineral estéril: enlentece le metabolismo microbiano y las células se mantienen viables durante 15-20 años.
• Liofilización: los conserva en forma de polvo deshidratado. Solo hay que rehidratar y sembrar para tener de nuevo al microorganismo.
• Almacenamiento a muy bajas temperaturas: por adición de nitrógeno liquido (que hay reponerlo porque se evapora), o conservación en ultracongeladores donde se conservan en presencia de un agente protector (glicerol) que impide la formación de cristales de hielo internos que puedan matar las células.

Los microorganismos, a diferencia de otros especímenes biológicos, siempre se conservan VIVOS en una colección de microorganismos.

Cultivo tipo y colecciones de microorganismos

Cepario. Colección de especies microbianas mantenidas en el laboratorio para distintos estudios: enseñanza, investigación, industria…

Cultivo tipo. El que se hace del microorganismo “representativo” de la especie (patrón de referencia).