Observación de microbios: microscopios, colorantes y tinciones

La observación microscópica es crucial en microbiología, permitiendo el estudio detallado de microorganismos. La evolución de los microscopios ha transformado esta disciplina, facilitando la identificación y caracterización de diversas especies.

Además, el uso de diferentes técnicas de tinción ha ampliado las posibilidades de análisis, permitiendo resaltar características morfológicas y estructurales que serían difíciles de apreciar sin estos métodos.

Técnicas de observación microscópica

La microbiología esta indudablemente unida al progreso de los microscopios. De hecho, la historia de la microbiología como ciencia comienza con la creación de microscopios. Para observar mejor a los microorganismos se han desarrollado colorantes, tinciones diferentes que se usarán en función de nuestro objetivo.

Microscopios

Un microscopio es un conjunto de lentes que concentran y enfocan la luz sobre una muestra para formar imágenes visuales. El concepto de microscopio se basa en una propiedad física de la luz: la difracción. Cuando un rayo de luz pasa por dos superficies distintas, que produce una desviación que produce un retraso en la velocidad conocido como índice de refracción, producido entre dos medios cuando la luz pasa a través de ellos.

Fundamentos de microscopía óptica

• Ampliación o aumento. Número de veces que aparece resaltado el tamaño de un objeto y que es el producto de la lente ocular por la objetiva.
• Contraste. Diferencia de intensidad lumínica que hay entre la muestra y el medio. Para aumentar el contraste se recurre a medios de tinción.
• Poder de resolución (PR). Depende de:
  • La longitud de onda (λ) de la luz visible usada (entre 0.4 y 0.7 µm)
  • La apertura númerica (AN). Es igual a n*sen θ donde
    • n. Es el índice de refracción del medio que atraviesa el haz, entre el cubreobjetos y el objetivo. Su valor es:
      • 1. En el aire.
      • 1.33. En agua.
      • 1.5. En aceite de inmersión.
    • θ. Es la mitad del ángulo del cono de luz que entra al objetivo desde la muestra.
• Límite de resolución (LR). Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para poder diferenciarlos como tales. La ecuación sería esta:

LR = λ / (2n * sen θ)

Con los microscopios normales no se puede observar a menos de 100nm; el objetivo máximo en un microscopio óptico es 100x (solo usando el aceite de inmersión, sino 50x).

Tipos de microscopios

• Microscopio de campo claro. Las muestras se visualizan al destacar sobre un fondo iluminado. Se puede aumentar el contraste sin necesidad de teñir. El contraste entre muestra y medio es muy pobre.

• Microscopio de fondo oscuro. Normalmente en las muestras el contraste entre la célula viva y el agua es muy difícil de resolver con un microscopio de campo claro. Pero este microscopio cambia las condiciones. Se coloca un condensador especial que impide el acceso de luz a la muestra directamente y sólo los rayos oblicuos que inciden son reflejados. Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de modo que sólo la luz reflejada o refractada por la muestra puede formar una imagen. Se observa una imagen con un fondo oscuro y los rayos oblicuos hacen que la muestra se vea iluminada o brillante. Se usa para visualizar microorganismos que son difíciles de teñir por sus características o no se ven con el microscopio normal. Organismos frágiles o que se tiñen muy mal. Ejemplos: La bacteria de la sífilis (Treponema palium) o las espiroquetas que son muy delgadas.
• Microscopía de contraste de fases. Permite visualizar células sin necesidad de tinción. El condensador tiene un diafragma anular que produce un cono hueco de luz, y un objetivo con anillo de fase en una placa cambiadora de fase. Las células tienen un índice de refracción (n) distinto al del medio y desvían los rayos de luz que las atraviesan. La luz que pasa a través de una muestra sufre un retardo. A lo largo del microscopio se intercalan uno o más anillos de fase, que hacen pequeños retrasos en la refracción de la luz cuando pasa de un medio a otro, y los amplifica. Hay dos tipos de luz: la directa y la en fase (retardada). Cuando los dos tipos se integran en el ocular, forman una imagen muy contrastada con áreas muy iluminadas (en fase) y otras muy oscuras (fuera de fase), que va a permitir visualizar la morfología y tamaño de células y composición citoplasmática, Phb, gránulos de volutina, si hay endosporas en formación.  Estos componentes no se observan de ninguna otra manera.
• Microscopio de interferencia diferencial. Este microscopio crea una imagen sobre la base de la detección de diferencias entre los n y el espesor de la muestra. Unos prismas generan dos ondas de luz polarizada plana en ángulo recto, una respecto de la otra. Una de las ondas pasa a través de la muestra, y la otra sirve de referencia, y pasa por una zona clara. Tras atravesar la muestra, las dos ondas se combinan e interfieren entre sí; llegan desfasadas al ojo y forman una imagen tridimensional. Si no hay muestra los dos haces llegan al mismo tiempo. Así, diversas estructuras aparecen claramente visibles, tales como paredes celulares, endosporas, gránulos, vacuolas y el núcleo de células eucariotas.
• Microscopio de luz UV. Utiliza una longitud de onda que está en el ultra violeta (200-300nm).
• Microscopio confocal. Usa como fuente de luz los rayos láser. Las muestras se marcan son fluorocromos en general. El rayo láser se dispone en todos los planos de la partícula, va analizando la muestra en distintos planos, y los superpone creándose un registro tridimiensional.
• Microscopía de fluorescencia. Consiste en detectar en la muestra qué emite luz, ya que ciertas moléculas y estructuras son fluorescentes y se excitan con energía radiante. Parte de esa energía que emiten es detectada por el microscopio (por ejemplo, la clorofila, que tienen sustancias fluorescentes naturales). En otras ocasiones se necesita marcar dichas estructuras o moléculas con fluorocromos, tales como la rodamina B o isotiocianato de fluoresceína para poder localizarlas. Un filtro excitador permite pasar la radiación excitada de la longitud de onda (λ) deseada, que es reflejada por el filtro dicroico, y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra. Las móleculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz de λ específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicroico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea la luz residual con la frecuencia de la luz de exitación. Su aplicación es en especial en microbiología médica y ecología microbiana.
• Microscopio de fuerza atómica (AFM). Se fundamenta en las interacciones atómicas de las partículas de la muestra que son captadas por un dispositivo situtado muy cerca de la muestra. Se trata de una sonda que se va moviendo sobre la muestra y recoge datos de las repulsiones atómicas (ondas desprendidas). Todo lo que detecta el dispositivo se transmite a través de un sistema informático, y en una pantalla se muestran los resultados tridimensionales.
• Microscopía electrónica. Usa una corriente de electrones que se desplaazan a través de unos lentes electromagnéticos y se van a proyectar sobre una muestra extremadamente fina que tiene que estar en condiciones de vacio extremo.
  • Microscopio electrónico de transmisión (MET). Se puede aumentar el contraste mediante la tinción negativa, o los métodos de sombrado o criofractura.
  • Microscopio electrónico de barrida (MEB). Útil para ver estructuras en 3 dimensiones.

Microscopio óptico vs Microscopio electrónico

En la siguiente tabla se pueden ver las diferencias entre el microscopio óptico y el microscopio electrónico.

	MO	ME
Aumento	1.000-1.500	> 100.000
Resolución máxima	0,2 µm	0,5 nm
Fuente de radiación	Luz visible	Haces de electrones
Lentes	Lentes  de vidrio	Lentes electromagnéticas colocadas simétricamente respecto al eje axial que enfocan el haz de electrones, a través de un tubo en el que se ha hecho vacío, sobre la muestra.
Fuente de contraste	Absorción de luz diferencial	Dispersión de electrones
Medio de desplazamiento	Aire	Alto vacío
Montaje de la muestra	Portaobjetos	Rejillas metálicas Tratamiento previo de las muestras

Observación de microorganismos. Preparaciones

Basicamente, se pueden observar a los microbios mediante 2 tipos de preparaciones:

• Preparación húmeda o fresca. En esta se observan los microorganismos vivos. Es típica de los microscopios de campo oscuro y de contraste de fases. Se usa en caso de que la morfología se altere al usar alguna tinción. Sirve para determinar la movilidad u observar cambios citológicos o algunas inclusiones.
• Preparación teñida. Permite ver a los microorganismos en función de su capacidad para retener o no determinados colorantes. La principal ventaja es que aumenta el contraste, acentuando las características morfológicas pero conservandolas. Los colorantes se usan para formar las tinciones.

Colorantes. Tinciones

Para mejorar el contraste entre los microorganismos y el medio lo que hlacemos es recurrir a las tinciones, tratando las muestras celulares mediante colorantes que son sustancias con una afinidad especial por determinados componentes o estructuras celulares. Como resultado de la tinción lo que vamos a observar son muuestras de microorganismos teñidas más contrastadas sobre un medio difuso (no teñido). En microbiología vamos a utilizar siempre preparaciones fijadas, es decir, muestras de células muertas, y para las tinciones se utilizan colorantes (no tintes).c

Todo colorante lleva dos partes:

• Grupo cromóforo. Parte de la molécula responsable del color, es el radical cromóforo. Se trata de moléculas alifáticas que suelen llevar un doble enlace conjugado (N=N) o un grupo sulfo (SO₂).
• Grupo auxocromo. Región de la molécula que no tiñe pero que facilita la interacción del radical cromóforo con la molécula que va  a teñir. Suelen ser radicales iónicos (OH^–, COO^–, NH₂⁺) muy activos con capacidad para interactuar.

Los colorantes se van a clasificar en función del grupo auxocromo:

• Grupo auxocromo ácido o aniónico (-). El grupo auxocromo es un anión y va a interaccionar con componentes celulares básicos de la célula, como el citoplasma y estructuras con carga positiva. Ejemplos: eosina, rojo-congo, fucsina, nigrosina.
• Grupo auxocromo básico o catiónico (+). El grupo auxocromo es un catión y va a interaccionar con regiones o zonas ácidas de la célula que tengan carga negativa, como con los ácidos nucleicos. En general todas las bacterias tienen una carga externa negativa: estos colorantes van a interaccionar sobre todo con la pared bacteriana. Ejemplo: safranina, azul de metileno, cristal violeta.
• Grupo auxocromo sin carga, liposoluble. Combinación de un anión y un catión que normalmente en solución para teñir se van a disociar en los dos átomos. Ejemplo: eosina de metileno, negro-sudán.

Fases de la tinción

Comprende varias partes:

• Extensión. Se toma la muestra y se extiende a lo largo del porta.
• Secado breve.
• Fijación. Normalmente se fijan suavemente con una llama, y es una fijación en un doble sentido: una fijación física que consiste en que la capa que hemos puesto quede pegada al cristal y una fijación biológica, de tal manera que cuando se aplica calor se desnaturalizan las estructuras celulares, se coagulan las proteínas en su conformación nativa de manera que ahora puedan tomar el colorante. Solo en algunos casos se puede acudir a una fijación química.
• Aplicación del colorante. Es el proceso de tinción en si mismo.
• Lavado.
• Observación.

Mecanismos de tinción

Fundamentalmente hay dos:

• Tinción por intercambio iónico. Si tenemos una bacteria con carga negativa y le añadimos azul de metileno, el grupo auxocromo desplaza a los cationes adheridos a la pared bacteriana y los sustituyen, liberándose cloruro sódico.
• Tinción por solubilidad diferencial del colorante entre la muestra y el medio. Las células en un medio acuoso tienen estructuras hidrofóbicas en su interior. Si teñimos con negro-sudán (que es lipofílico) no se disuelve en el agua y se une a las regiones hidrofóbicas (o con un alto contenido en lípidos), y así tiñe.

Tipos de tinciones

• Simple. Aplica un único colorante que tiñe completamente las células. Normalmente es con azul de metileno. No es muy útil (se obtiene información sobre la forma y variedad, pero poco mas).
• Diferencial. Incorpora 2 colorantes de forma excluyente (cada bacteria se teñirá con uno de ellos, pero no con los dos). Tinción de GRAM (1884) y tinción de Ziehl-Neelsen (para las bacterias acido-acohol resistentes).
• Específica o selectiva. El colorante se adhiere y tiñe determinadas estructuras especificas de la célula por las que tiene afinidad. Endosporas, volutinas, flagelos. Leifson, con rosanilina (que tiene acido tánico), aumenta la visibilidad del flagelo, que se fija con formol. Como ejemplos tenemos la tinción negativa, la de flagelos, o endosporas.  

En el artículo que enlazamos a continuación podrás ver las tinciones y colorantes principales usados en microbiología.

Tinción de Gram

Data del año 1884, por Hans Christian Gram. La preparación consta de varias partes:

1. Se prepara el frotis, y se tiñe en primer lugar con cristal violeta (generalmente durante 1min, aunque el tiempo depende de la pureza del colorante). TODAS las células se tiñen de color azul violeta.
2. Se añade lugol, que es una solución de Iodo y ioduro potásico que tiene función de mordiente es decir se une con el cristal violeta y forma un complejo insoluble que queda atrapado y absorbido dentro de las células.
3. Esta es la etapa crítica: decolorar con alcohol de 96º. Todas las células toman el primer colorante pero cuando le añadimos el alcohol, las GRAM- pierden el colorante, mientras que las GRAM+ siguen coloreadas.
4. Ahora añadimos el colorante de contraste, en este caso, la safranina, la cual tiene que tener un grupo cromóforo que no sea violeta, que suele ser rojo rosa. Ahora las GRAM+ se ven color violeta y las GRAM- de color rosa.

Es preferible utilizar cultivos jóvenes, para evitar alteraciones en la pared y por lo tanto, confusiones. Si se abusa del alcohol se puede extraer la tinción de las GRAM+ por lo que hay que tener cuidado.

Para ver la tinción de Gram con más detalle tienes el siguiente artículo donde se analiza la tinción de Gram además de otras tinciones y colorantes usados en microbiología.